1、目的：探討髓樣細胞表達的激發(fā)受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)在真菌性角膜炎中的表達及其作用的分子機制。
　　方法：分別以真菌性角膜炎患者、真菌性角膜炎動物模型為對象研究TREM-1在機體中的表達規(guī)律；體外培養(yǎng)人角膜上皮細胞，研究TREM-1在真菌感染的人角膜上皮細胞中的表達和調控機制。實驗分為三部分：（1)選擇2012年9月至2013年10月

2、在青島大學附屬醫(yī)院眼科就診的真菌性角膜炎初診患者25例（25眼)為患者實驗組，并根據角膜潰瘍炎癥反應程度再分為輕度炎癥組、中度炎癥組和重度炎癥組，收集角膜病灶周邊角膜上皮組織；制作角膜植片后剩余的周邊角膜的健康供體5例＃5眼)為患者對照組，收集植片外圍角膜緣2mm內角膜上皮；RT-PCR檢測各組角膜上皮中TREM-1的表達及其與炎癥反應程度的關系。健康Wistar大鼠隨機分為空白對照組（角膜未予任何處理）、損傷對照組（刮除角膜上皮后僅覆

3、蓋角膜接觸鏡，不接種真菌）和真菌感染組（刮除角膜上皮后覆蓋角膜接觸鏡，接種真菌），根據角膜感染程度進行評分；刮取各組角膜上皮行RT-PCR、Western blot檢測TREM-1的表達及其與角膜感染程度的關系；完整摘除角膜組織，免疫熒光染色檢測TREM-1在角膜中的定位表達。（2)體外培養(yǎng)人永生化角膜上皮細胞，分別加入煙曲霉菌菌絲刺激液、煙曲霉菌孢子刺激液，RT-PCR檢測不同時間點角膜上皮細胞中TREM-1的表達，篩選作用顯著的刺激

4、液，Western blot檢測該刺激液對TREM-1蛋白表達的影響；RT-PCR檢測不同濃度LP17(TREM-1選擇性抑制劑）預處理后煙曲霉菌刺激液誘導的角膜上皮細胞TREM-1表達改變以及TREM-1阻斷對煙曲霉菌刺激液誘導的角膜上皮細胞炎癥因子分泌的影響。（3)研究TREM-1與Toll樣受體-4(Toll like receptor-4，TLR-4)之間的協(xié)同作用，分別使用TREM-1抑制劑LP17、TLR-4抑制劑CLI-0

5、95和MyD88(TLR信號通路下游因子）抑制劑ST2825預處理體外培養(yǎng)的人永生化角膜上皮細胞，Western blot檢測煙曲霉菌孢子刺激液誘導的TREM_1、TLR_4和MyD88蛋白表達；RT-PCR檢測分別/聯(lián)合抑制TREM-1、TLR-4對煙曲霉菌孢子刺激液誘導的角膜上皮細胞炎癥因子分泌的影響。
　　結果：（1)與對照組相比，真菌性角膜炎患者輕度炎癥組、中度炎癥組和重度炎癥組中TREM-1 mRNA的表達均顯著升高，而

6、且隨炎癥程度加重，TREM-1表達升高越明顯，各組之間差異有統(tǒng)計學意義（代0.05)。動物實驗中，真菌感染組8h起角膜上皮TREM-1 mRNA表達量較空白對照組不斷升高，48h達到高峰，各時間點之間差異具有高度統(tǒng)計學意義(代0.001)；16h起，真菌感染組角膜上皮中TRME-1 mRNA的表達量均明顯高于損傷對照組，差別有統(tǒng)計學意義（K0.001);真菌感染組24h、48 h角膜上皮TREM-1蛋白表達水平隨時間升高，且均明顯高于空

7、白對照組(P70.05)；免疫熒光染色結果發(fā)現(xiàn)，空白對照組大鼠角膜TREM-1表達主要位于角膜上皮層，真菌感染組大鼠角膜TREM-1表達明顯升高，主要位于角膜上皮和角膜基質；真菌感染組大鼠角膜炎癥反應程度與角膜上皮中TREM-1表達水平呈正相關(r=0.942，K0.001)。（2)煙曲霉菌孢子刺激液刺激體外培養(yǎng)的角膜上皮細胞時，TREM-1表達升高較菌絲刺激液更加明顯，兩組差異有統(tǒng)計學意義(K0.05); Western blot結果

8、顯示，煙曲霉菌孢子刺激液加入細胞中4h，TREM-1蛋白表達升高，8h TREM-1蛋白表達達到高峰，各時間點與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(代0.05)終濃度為10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的LP17均可抑制煙曲霉菌孢子刺激液誘導的角膜上皮細胞TREM-1 mRNA表達升高，抑制效果呈濃度依賴性，各濃度組之間TREM-1表達差異均有統(tǒng)計學意義（代0.05);100ng/ml LP17能夠顯著抑制煙曲霉菌孢子刺激液

9、誘導的角膜上皮細胞TNF-a、IL-10、IL-6和IL-8分泌(K0.05)。(3) LP17能夠顯著抑制煙曲霉菌孢子刺激液誘導的角膜上皮細胞TREM-1、TLR-4和MyD88蛋白表達，CLI-095預處理也能夠部分阻斷煙曲霉菌孢子刺激液誘導的角膜上皮細胞TREM-1和TLR-4表達上調，此外ST2825同樣可以有效抑制TREM-1表達；LP17和CLI-095預處理均能不同程度的抑制TNF- a、IL-10、IL-6和IL-8分泌

10、，兩者對炎癥因子的抑制程度沒有明顯差別（P>0.05)，但兩種抑制劑聯(lián)合使用時各種炎癥因子的表達與單獨抑制組相比差異均有統(tǒng)計學意義(代0.05)。
　　結論：（1) TREM-1介導的炎癥放大作用與真菌性角膜炎的炎癥反應進程密切相關;(2) TREM-1阻斷可以顯著抑制真菌感染后角膜上皮細胞炎癥因子的釋放，是抑制角膜炎癥反應的潛在靶點；（3) TREM-1與TLR-4在介導真菌感染后角膜上皮炎癥反應過程中具有協(xié)同促進作用；（4)真