1、目的:本實驗旨在探討臍帶血CD34+造血干細胞來源的樹突狀細胞（CD34-DC）與外周血單核細胞來源的樹突狀細胞(Mo-DC)在細胞形態(tài)、細胞表型、誘導生成的CTL細胞毒性方面的差異，并探討不同來源的DC超微結構的變化與其抗原處理與抗原提呈功能之間的相關性，以期制備功能更加強大的DC疫苗。
　　方法:取健康成人外周血，采用密度梯度離心法獲取單核細胞后誘導生成DC(Mo-DC);取健康足月產孕婦臍帶血，采用磁珠分選法分離純化CD34

2、+造血干細胞，并培養(yǎng)于含粒細胞-巨噬細胞刺激因子(GM-C SF)/干細胞因子(SCF)的培養(yǎng)基誘導CD34+造血干細胞擴增及DC前體細胞的生成，GM-CSF/白細胞介素-4(IL-4)培養(yǎng)基進一步誘導前體細胞向DC細胞的分化(CD34-DC)。電鏡下觀察CD34-DC及Mo-DC的形態(tài)，比較其細胞突起數量、細胞核大小及內體小泡數量;流式細胞術檢測不同培養(yǎng)時間(d1，d3，d5，d7)的CD34-DC及Mo-DC表面分子表達，并給予FI

3、TC-OVA257-264沖擊，培養(yǎng)24小時后檢測其抗原提呈能力;取培養(yǎng)至d5的CD34-DC及Mo-DC均負載CEA蛋白并加入腫瘤壞死因子(TNF-α)制備成CEA特異性的CD34-mDC、Mo-mDC（即DC疫苗），分別體外誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)生成，并利用MTS法檢測其各自對CEA高表達的腫瘤細胞系Ls174-T的細胞毒性，以檢測其激活T細胞的功能。
　　結果:
　　1、光學倒置顯微鏡觀察兩種細胞來源的d0，

4、d3，d7的CD34-DC、Mo-DC及負抗原后DC疫苗的形態(tài)學變化。
　　D0時細胞均為圓形或橢圓形，且在細胞膜表面有微小突起，d3兩種來源的DC均表現出樹突狀，Mo-DC突起較少且細長，呈梭形，而CD34-DC突起較多且粗短，d7 Mo-DC突起更加明顯，且筆直，窄并伴以針尖狀尾部，但CD34-DC突起相對較短且部分突起分叉，細胞膜粗糙不規(guī)整。整體來看，CD34-DC的突起形成比Mo-DC早。經過細胞因子和腫瘤抗原刺激之后的D

5、C，懸浮生長而失去樹突狀外觀，表現為類圓形，細胞膜清晰且光滑。
　　2、電鏡觀察CD34-DC、Mo-DC超微結構變化
　　分別觀察d3、d5、d7的CD34-DC、Mo-DC樹突狀突起數量、細胞核大小及內體小泡數量。CD34-DC的突起數量在d5上升、d7下降，而Mo-DCs的突起數量d3-d7是逐漸減少的。CD34-DC細胞核直徑于d3、d5、d7分別為5.2±0.3、6.54±0.4、7.34±0.3，而Mo-DC為5

6、.1±0.2、5.2±0.4、5.46±0.4，結果表明，培養(yǎng)7天后，CD34-DC細胞核比Mo-DC大（P＜0.05）。CD34-DC的胞漿內體小泡數量于d3、d5、d7分別為29.74±3.23、31.73±4.2、38.24±2.5，Mo-DC分別為:26.28±3.2、24.55±3.7、22.68±2.9，結果表明，培養(yǎng)7天后，CD34-DC的胞漿內體小泡數量比Mo-DC多(P＜0.05)。上述結果表明，與抗原提呈能力密切相關

7、的內體小泡數量在CD34-DC中多于Mo-DC。
　　3、流式細胞儀檢測不同來源的DC表面分子CD80、CD83、CD86表達率。
　　Mo-DC表面CD80的表達率于d1-d7都極低，而CD83、CD86的表達率呈逐漸升高趨勢，在經腫瘤抗原及促成熟細胞因子刺激生成Mo-mDC后三種分子均可迅速升高。CD34-DC表面CD80、CD83、CD86的表達率于d1-d7均呈逐漸升高趨勢，經腫瘤抗原及細胞因子刺激生成CD34-mD

8、C后表達率亦可迅速升高。Mo-mDC與CD34-mDC相比，三種表面分子表達率均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05，P＞0.05，P＞0.05），說明Mo-DC與CD34-DC經抗原及細胞因子刺激生成的Mo-mDC與CD34-mDC均可成熟。
　　4、取培養(yǎng)d1、d3、d5、d7的CD34-DC、Mo-mDC，分別用FITC標記的OVA257-264沖擊后，用流式細胞儀檢測其在不同時間的抗原提呈能力。
　　D1，CD34-DC中陽性

9、細胞率為15.27％±1.47，Mo-DC只有5.16％±1.00。在d3、d5、d7，兩種DC陽性細胞率均呈上升趨勢，d7時，CD34-DC的陽性細胞表達率達到81.8％±1.5，而Mo-DC只有57.2％±1.4，CD34-DC較Mo-DC上升更加明顯(P＜0.05)，說明CD34-DC比Mo-DC具有更強的抗原提呈能力。
　　5、MTS法檢測DCs刺激同種異體T淋巴細胞的增殖能力。
　　取兩種來源的未成熟DCs按1∶1

10、分別與T淋巴細胞共培養(yǎng)4天，結果顯示，以無DC刺激的T細胞作為對照，經CD34-DC刺激后T淋巴細胞增值率為208±39％，Mo-DC增值率為156±48％。兩者無顯著性差異(P＞0.05)。說明CD34-DC與Mo-DC在刺激同種異體T淋巴細胞的增殖能力方面無差異。
　　6、負載CEA生成的CD34-mDC與Mo-mDC疫苗分別激活的CTL對CEA高表達的Ls174-T腫瘤細胞的殺傷效率對比。
　　CEA特異性CD34-m

11、DC激活的CTLs(CC-CTLs)在效靶比為10∶1、50∶1、100∶1時對LS174-T的殺傷率分別為63.3±1.52％、80.6±2.51％、90±2.0％。CEA特異性Mo-mDC疫苗誘導激活的CTLs(CM-CTLs)對LS174-T殺傷率分別為35±2.64％、53.6±3.21％、68.6±3.51％。結果顯示，CC-CTLs及CM-CTLs都可以殺傷CEA高表達的腫瘤細胞Ls174-T，但CC-CTLs比CM-CTL

12、s有更高的殺傷率(P＜0.05)。
　　結論:
　　1、經GM-CSF/SCF培養(yǎng)基可誘導臍帶血CD34+造血干細胞擴增及生成DC前體細胞，并在培養(yǎng)d8開始貼壁生長，每3天可收獲一批DC前體細胞，用GM-CSF/IL-4培養(yǎng)基可進一步誘導生成CD34-DC，其表型與Mo-DC無差異。
　　2、臍血造血干細胞來源的CD34-DC具有更強的抗原提呈、促淋巴細胞增殖及誘導激活CTL的能力。
　　3、電鏡下樹突狀突起數量