柿葉提取物對阿爾茨海默病細胞模型的抗氧化作用及機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景
  隨著世界老齡化的不斷加劇,衰老及相關退行性相關的疾病受到越來越多研究者的重視。神經系統退行性疾病在衰老疾病中占重要分支,如帕金森氏病,阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)等。AD是一種以認知功能障礙、人格改變?yōu)橹饕R床癥狀的慢性進展性中樞神經系統退行性疾病,是癡呆的最常見原因。AD發(fā)病機制尚不明確,且無特效藥。為了更好的防治衰老疾病、提高老年人生活質量、減輕社會負擔,探討退行性病變的病理機制、

2、研發(fā)有效延緩退行進程的藥物有重要意義。
  淀粉樣蛋白級聯反應是AD治病機制中的重要假說。不可溶的β淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)聚集而成的原纖維具有神經毒性,也是老年斑的組成成分。Aβ聚合會引發(fā)氧化應激反應,線粒體功能受損,使ROS增多。而氧化應激又會進一步促進Aβ聚集及微管相關蛋白tau的磷酸化,加重AD大腦中的氧化還原反應的失衡。氧化應激是將多種不同的致病機制聯絡在一起的共同關鍵點,因此尋找合適的抗氧

3、化劑和多靶點的治療方法,進行適當的臨床干預,是防治AD的有效手段。
  Nrf2/HO-1在機體內源性抗氧化系統中有至關重要的地位,是最重要的抗氧化通路。Nrf2作為轉錄因子能啟動機體的抗氧化通路。在受到氧化刺激時,Nrf2由胞質轉位進入胞核,啟動抗氧化酶相關基因的表達,通過調控下游氧化還原基因網,來維持細胞內氧化還原狀態(tài)的平衡。HO-1是Nrf2下游的抗氧化酶之一,通過對線粒體功能的恢復起到保護神經元的作用。Nrf2/HO-1是

4、機體維持氧化平衡的保護系統。
  近來發(fā)現,柿葉具有抗氧化,降血脂,降血糖,抗菌,止血等藥效。臨床病例分析報道,柿葉提取物在改善后循環(huán)缺血的療效上優(yōu)于銀杏葉提取物。由柿葉提取物制成的腦心清片,可清除氧自由基,防止神經元興奮性毒性作用,從而保護腦血管意外引起的腦損傷。在臨床治療中柿葉提取物已被廣泛應用,尤其在腦血管病的相關領域中嶄露頭角。我們前期研究結果發(fā)現,柿葉提取物(Persimmon leaf extract,PLE)可以改善

5、D-半乳糖致衰老小鼠的學習與記憶能力,提高抗氧化酶SOD,GSH-Px活性,那么在神經細胞中尤其是AD細胞模型中,是否也有相同的作用?是否可以通過減少Aβ的聚集、減輕ROS的活性,調節(jié)Nrf2/HO-1的表達來發(fā)揮神經保護作用?
  基于以上背景,本研究主要探討柿葉提取物對AD細胞模型的是否有抗氧化作用,以及Nrf2和HO-1是否參與到抗氧化的調節(jié)中,為AD的藥物研發(fā)提供依據。
  目的:
  采用攜帶瑞典突變APP基

6、因的HEK293細胞(20E2)作為AD細胞模型,通過檢測細胞上清Aβ1-42的水平,細胞內ROS的熒光強度,線粒體膜電位的變化等相關指標,探討PLE對細胞抗氧化應激的作用,并從核Nrf2/HO-1信號通路研究其作用機制。
  方法:
  1.Western Blotting檢測SH-SY5Y和20E2細胞中APP蛋白表達水平;ELISA檢測兩組細胞上清Aβ1-40,以確定該病理模型是否建立成功。
  2.CCK-8檢

7、測不同濃度的PLE對兩組細胞活性的影響,選定干預最佳濃度。
  3.設分組:SH-SY5Y為空白對照組(NC組)20E2為模型組(20E2組),用柿葉提取物干預為加藥組(20E2+PLE組)。
  4.DCFH-DA探針檢測各組細胞內ROS的變化。
  5.JC-1檢測線粒體膜電位的變化。
  6.ELISA檢測各組細胞上清Aβ1-42的量。
  7.Western Blotting分析胞核Nrf2、胞漿N

8、rf2和全細胞HO-1蛋白的表達差異。
  結果:
  1.檢測兩種細胞中的APP、Aβ1-42蛋白表達:
  與SH-SY5Y細胞相比,20E2細胞APP表達量明顯增加(P<0.01),Aβ1-40的量明顯增加(P<0.01)。
  2.CCK-8檢測不同濃度的PLE對兩組細胞活性的影響:
  結果顯示PLE在1.5-6μ g/mL可增加SH-SY5Y細胞活性(*P<0.05);PLE在3-6μg/mL可

9、增加20E2細胞活性(#P<0.05),超過6μg/mL后也有抑制細胞活性的趨勢。
  3.DCFH-DA熒光探針檢測各組細胞ROS的表達:
  與NC組相比,20E2組細胞內ROS熒光信號明顯增強(P<0.05);PLE干預后,20E2+PLE組ROS熒光信號減弱(P<0.05)。
  4.JC-1檢測線粒體膜電位結果:
  較NC組細胞,20E2組細胞,紅色熒光較弱(P<0.05),綠色熒光較強(P<0.05

10、),線粒體膜電位降低;用PLE干預后,20E2+PLE組細胞內的紅色熒光強度增強(P<0.05),綠色熒光較弱(P<0.05),線粒體膜電位有上升。
  5.ELISA檢測細胞外Aβ1-42濃度結果:
  與NC組細胞相比,20E2組細胞外Aβ1-42明顯增多(P<0.05);PLE干預后,20E2+PLE組細胞外Aβ1-42明顯減少(P<0.05)。
  6.分析胞核Nrf2、胞漿Nrf2和全細胞蛋白HO-1的表達差

11、異:
  相比于NC組,20E2細胞中Nrf2蛋白和HO-1蛋白表達增多(P<0.05);相比于模型組,加藥組中胞核Nrf2表達增加,胞漿Nrf2表達減少,全細胞蛋白HO-1增多(P<0.05)
  結論
  PLE能明顯降低細胞外Aβ的濃度,減少ROS的產生,恢復線粒體膜電位水平??赡苁峭ㄟ^激活了Nrf2/HO-1信號途徑,促進Nrf2合成和核轉位,從而促進下游抗氧化蛋白HO-1的表達來減弱氧化應激的損傷。因此,PL

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