1、本文主要從以下兩部分展開論述：
　　第一部分：口服強化阿托伐他汀聯(lián)合阿托伐他汀預處理提高骨髓間充質干細胞治療急性心肌梗死療效的實驗研究
　　目的:骨髓來源的間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是進行急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后心肌修復的一種有效的干細胞來源，但療效有限，原因之一是歸巢并存活于梗死心肌的MSCs數(shù)量較少?；|細胞衍生因子1(s

2、tromal cell-derived factor-1，SDF-1)與其特異性受體趨化因子受體4(CXCchemokine receptor4，CXCR4)構成的SDF-1/CXCR4軸在MSCs歸巢、定植到損傷部位參與修復的過程中發(fā)揮重要作用。我們的前期研究表明，口服強化阿托伐他汀(atorvastatin，ATV)能改善梗死微環(huán)境促進MSCs存活，而且ATV預處理能增加MSCs表面CXCR4的表達，提高MSCs的歸巢能力。本研究旨

3、在探討口服強化ATV聯(lián)合移植ATV預處理的MSCs(ATV-MSCs)是否可以進一步改善心梗后心功能，并明確其作用是否是通過SDF-1/CXCR4軸發(fā)揮的。
　　方法:第一部分將6-8周齡雌性Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術組(Sham)、心梗對照組(AMI)、AMI后口服強化ATV組，分別于AMI后1天、1周和2周取材，通過免疫組化、RT-PCR和ELISA測定梗死周邊心肌組織SDF-1的動態(tài)變化，選擇SDF-1表

4、達高峰作為第二部分移植MSCs或ATV-MSCs的時間點。第二部分將大鼠隨機分為Sham組，AMI對照組，移植MSCs組，口服強化ATV組，移植ATV預處理的MSCs(ATV-MSCs)組，口服強化ATV聯(lián)合移植MSCs(ATV+MSCs)組，同時口服強化ATV聯(lián)合移植ATV預處理的MSCs(ATV+ATV-MSCs)組，ATV+ATV-MSCs+AMD3100(SDF-1/CXCR4阻滯劑)組。采用結扎冠狀動脈前降支的方法制作急性心肌

5、梗死模型，梗死后1周經頸靜脈注射CM-Dil標記的MSCs或ATV-MSCs(2×106細胞/只)。梗死后4周通過心臟超聲和左心導管檢測心功能;通過病理組織學檢測歸巢至梗死心肌的MSCs、炎癥細胞浸潤及纖維化，TUNEL法檢測凋亡;通過蛋白芯片檢測梗死周邊心肌組織中促炎和抗炎因子的水平;通過免疫熒光法檢測血管新生、內源性c-Kit+干細胞的數(shù)量以及MSCs向心肌分化情況。
　　結果:與AMI組相比，口服強化ATV可顯著提高SDF-

6、1的mRNA和蛋白表達，在1周時達高峰，選擇1周作為MSCs移植時間點。與MSCs組相比，ATV-MSCs或ATV+MSCs組能夠顯著提高左室射血分數(shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)和等容收縮期左室內壓力上升的最大速率(dp/dt)，顯著降低左室舒張末期直徑(LVEDd)、左室收縮末期直徑(LVESd)和左室舒張壓力(LVEDP);ATV+ATV-MSCs組的LVEF和LVFS與ATV-MSCs組相比進一步提高，LVEDP和dp

7、/dt與ATV-MSCs組和ATV+MSCs組相比均有顯著改善;而加入AMD3100阻斷SDF-1與CXCR4的結合后，ATV+ATV-MSCs對左心收縮和舒張功能的改善作用均被明顯抑制。組織學分析顯示，與MSCs組相比，ATV-MSCs和ATV+MSCs組的心肌纖維化面積顯著減小，炎細胞浸潤明顯減輕;ATV+ATV-MSCs組炎細胞浸潤進一步減少，與ATV-MSCs組相比，纖維化面積顯著減小，上述作用可被AMD3100部分阻斷。蛋白芯

8、片結果顯示，在梗死周邊心肌組織中，與AMI組相比，ATV+ATV-MSCs組的炎癥因子IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α均下降最為顯著，抑炎因子IL-10水平明顯升高。ATV-MSCs和ATV+MSCs組歸巢到梗死周邊區(qū)心肌組織的MSCs數(shù)、新生動脈數(shù)和毛細血管數(shù)均明顯高于MSCs組，心肌細胞的凋亡顯著少于MSCs組;ATV+ATV-MSCs組的歸巢MSCs數(shù)和新生毛細血管數(shù)與ATV-MSCs和ATV+MSCs組相比進一步提高

9、，心肌細胞凋亡數(shù)繼續(xù)顯著減少;上述指標在給予AMD3100后均受到顯著抑制。與AMI組相比，移植MSCs組的心肌組織中內源性c-Kit+干細胞數(shù)顯著增多，ATV+ATV-MSCs組進一步提高了c-Kit+干細胞的數(shù)量，但并未顯著增加MSCs向心肌細胞的分化。
　　結論:ATV預處理或口服強化ATV均可以增強MSCs向梗死心肌的歸巢，二者聯(lián)合可通過SDF-1/CXCR4軸進一步增加MSCs的歸巢和內源性c-Kit+干細胞數(shù)量，促進血

10、管新生，抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應，減少纖維化面積，提高心肌梗死后心功能。口服強化ATV聯(lián)合移植ATV預處理的MSCs可能成為提高干細胞療效的一有效方法。
　　第二部分：球形脂聯(lián)素降低缺氧無血清誘導骨髓間充質干細胞凋亡的實驗研究
　　目的:骨髓來源的間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在惡劣的梗死微環(huán)境中的低存活率極大限制了其治療急性心肌梗死的療效。脂聯(lián)素(adiponectin，APN）是

11、一種脂肪細胞分泌的細胞因子，球形脂聯(lián)素(globular adiponectin，gAPN)是其C端球形結構域，可以抗多種細胞凋亡，并具有干細胞調控特性。脂聯(lián)素主要通過與細胞表面的脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)或受體2(AdipoR2)結合發(fā)揮生物學作用。單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是調控細胞能量代謝的核心分子，在調節(jié)細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。因此我們在體外建立缺氧無血清(h

12、ypoxia and serum deprivation, H/SD)模型來模擬心肌梗死后體內缺血缺氧的微環(huán)境，探討脂聯(lián)素能否減少MSCs的凋亡，并明確發(fā)揮作用的受體和下游的信號通路。
　　方法:分離并培養(yǎng)34周齡雄性Sprague-Dawley大鼠骨髓MSCs，將第3代細胞隨機分為正常對照組、H/SD對照組、不同濃度梯度gAPN組(0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL)、通過小干擾RAN(small interfe

13、ring RNA，siRNA)干擾AdipoR1組、干擾AdipoR2組、干擾AdipoR1+AdipoR2組、AMPK通路抑制劑CompoundC組(10μM)。在熒光顯微鏡下觀察Hocchst33342染色陽性細胞，AnnexinⅤ/PI流式細胞術檢測各組細胞的凋亡比例，Caspase-3活性試劑盒檢測Caspase-3活性;熒光探針JC-1染色檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MM

14、P)的變化，并進一步采用Western blot方法檢測凋亡相關蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2水平及AMPK及其磷酸化蛋白的水平。
　　結果:gAPN劑量依賴性的降低H/SD誘導的MSCs凋亡，表現(xiàn)為核皺縮和變性(Hocchst33342染色陽性)細胞減少，早期凋亡(AnnexinⅤ+/PI-)細胞和晚期凋亡(AnnexinⅤ+/PI+)細胞均呈劑量依賴性減少，Caspase-3活性降低，在1μg/mL濃度時最為明顯。

15、干擾AdipoR1的表達可明顯抑制gAPN的抗凋亡作用，而干擾AdipoR2的表達對gAPN的抗凋亡作用無顯著影響。gAPN各組AMPK的磷酸化水平升高，加入Compound C抑制AMPK的磷酸化后，gAPN的抗凋亡作用被顯著抑制。此外，gAPN升高抗凋亡蛋白Bcl-2、抑制促凋亡蛋白Bax的表達，抑制了線粒體膜電位的喪失，而干擾AdipoR1表達或加入Compound C后gAPN的上述作用被部分抑制。
　　結論:gAPN可以