1、熱激蛋白HSP70通過ATPase循環(huán)完成其功能。多種蛋白及輔助分子伴侶參與HSP70的ATPase循環(huán)，如J蛋白和底物能夠刺激HSP70水解ATP生成ADP，而ADP脫離HSP70則需要核苷酸交換因子(Nucleotide Exchange Factors，NEFs)的協(xié)助，因此，NEFs是HSP70分子伴侶體系中的一類關鍵輔助因子。目前，NEFs的研究多集中于原核生物(大腸桿菌中的GrpE)、酵母(Fes1p、Sse1p)和哺乳動物

2、(Bag-1、HspBP1)中，有關植物NEFs的研究尚未見報道。為此，作者對酵母Fes1基因在擬南芥中的同源物進行了研究。
　　擬南芥基因組中存在三個Fes1基因的同源物，它們都歸屬于ARM(Armadillo repeat)蛋白家族。作者將它們命名為AtFes1A(At3g09350)、AtFes1B(At3g53800)、AtFes1C(At5g02150)。Real-Time PCR實驗證實，在這三個成員中，AtFes1A

3、是高溫誘導下表達量最高的一個，所以作者主要研究了AtFes1A基因。對AtFes1A的定位和表達特性進行研究，發(fā)現(xiàn)AtFes1A是一個定位在細胞質(zhì)中的，受高溫誘導表達的蛋白。作者自ABRC訂購了AtFes1A基因的T-DNA插入突變體(salk-021784和salk-012416)，對AtFes1A基因的功能進行研究。最后，作者以熱敏感的北美螢火蟲螢光酶作為靶標蛋白，研究了AtFes1A基因缺失導致擬南芥熱敏感的原初起因。
　　

4、主要實驗結(jié)果如下:
　　1.擬南芥基因組中存在三個Fes1的同源基因:AtFes1A、AtFes1B和AtFes1C。AtFes1A是三個成員中高溫誘導表達最高的一個基因。在Fes1基因缺失酵母中導入高拷貝質(zhì)粒pYX242攜帶的AtFes1A基因的cDNA序列，發(fā)現(xiàn)酵母的熱敏感表型基本得到恢復，說明在耐熱方面，AtFes1A具有與酵母Fes1相似的功能。
　　為確定AtFes1A基因的表達特性，作者檢測了該基因在高溫、低溫、

5、干旱、NaCl脅迫下的表達水平。實驗結(jié)果表明，AtFes1A基因的表達受高溫誘導強烈表達，在低溫和干旱脅迫下表達稍有上調(diào)，NaCl不能誘導AtFes1A基因的表達。利用農(nóng)桿菌侵染的方法，將含有AtFes1A基因的cDNA序列和GFP基因的融合基因轉(zhuǎn)化擬南芥，GFP熒光分析發(fā)現(xiàn):GFP在保衛(wèi)細胞和原生質(zhì)體的細胞質(zhì)中表達，說明AtFes1A基因定位在細胞質(zhì)中。
　　為檢測AtFes1A蛋白能否加速ADP脫離從而提高HSP70蛋白的AT

6、Pase活性，作者利用孔雀綠-鉬酸銨分光光度法進行了穩(wěn)態(tài)的ATPase實驗，通過檢測 HSP70水解ATP產(chǎn)生無機磷的速度來判斷AtFes1A是否對HSP70具有刺激作用。實驗結(jié)果表明，高濃度或低濃度的AtFes1A對HSP70的ATPase活性都沒有明顯的影響，說明AtFes1A可能不具有刺激ADP加速脫離HSP70的功能。
　　2.自 ABRC訂購了AtFes1A基因的T-DNA插入突變體(salk-021784和salk-0

7、12416)。通過PCR及測序?qū)-DNA插入 AtFes1A基因的位置進行鑒定。salk-021784和salk-012416突變體中T-DNA分別插入AtFes1A基因的第六外顯子和第五內(nèi)含子上，突變體的純合子中檢測不到AtFes1A基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白。獲得耐熱性實驗表明，與野生型相比，突變體在下胚軸延伸時期和幼苗時期都有明顯的獲得耐熱性缺陷，突變體種子萌發(fā)時期的耐熱性也明顯降低。突變體 salk-021784的互補實驗表明，At

8、Fes1A基因的表達能夠基本修復突變體的熱敏感表型。以上結(jié)果充分說明，突變體的熱敏感表型確實是由于AtFes1A基因敲除引起的。
　　3.為研究AtFes1A基因突變導致擬南芥熱敏感的原因，作者檢測高溫處理后，與耐熱相關的HSPs(HSP70、HSP101、sHSP classI和sHSP classII)基因和Hsfs(HsfA2和HsfB1)基因轉(zhuǎn)錄本的表達情況。Northern雜交結(jié)果顯示，與野生型相比，突變體salk-02

9、1784中HSPs和Hsfs基因的轉(zhuǎn)錄本水平較高。為驗證實驗結(jié)果的可靠性，作者利用Real-Time PCR對突變體(salk-021784和salk-012416)中耐熱相關的HSPs和Hsfs基因的轉(zhuǎn)錄本進行了檢測，所得結(jié)果Northern雜交的結(jié)果一致。以上結(jié)果充分說明，AtFes1A基因缺失導致耐熱相關的熱激蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本升高。因此，AtFes1A是熱激蛋白信號轉(zhuǎn)導的負調(diào)控因子。
　　HSP70的高表達能夠抑制其他熱激蛋

10、白的表達。在salk-021784中，HSP70以及其他的一些熱激基因的轉(zhuǎn)錄本都上調(diào)，HSP70的高表達并沒有起到抑制作用。因此，作者檢測了salk-021784突變體中HSP70蛋白水平的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，突變體中的HSP70的蛋白含量并沒有因為其轉(zhuǎn)錄本的升高而升高，而是明顯低于野生型中的。本研究首次報導了AtFes1A能夠影響HSP70的穩(wěn)定性。
　　4.作者利用western-blotting雜交檢測了熱激后，s

11、alk-021784和野生型擬南芥中全蛋白的泛素化程度。Western-blotting雜交結(jié)果表明，與野生型相比，salk-021784突變體中有更多的變性蛋白底物被標記了泛素分子，突變體中有更多的變性蛋白被蛋白酶降解。
　　為更進一步的研究擬南芥熱敏感的原因，作者構(gòu)建了番茄線粒體小分子熱激蛋白 LeHSP23.8啟動子驅(qū)動的螢光酶基因的植物表達載體，利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化salk-021784和野生型擬南芥。轉(zhuǎn)螢光酶基因擬南芥在

12、38℃適應2h以激活螢光酶的表達(熱激啟動子驅(qū)動)，隨后45℃高溫處理2h滅活螢光酶，放置在培養(yǎng)箱中恢復，檢測恢復不同時間的螢光酶的活力。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型中的螢光酶相比，突變體中的螢光酶的復性程度明顯較低。此外，作者還利用western-blotting檢測了恢復不同時間的可溶性的螢光酶的水平。實驗結(jié)果顯示，在突變體中的可溶性螢光酶的含量較低，此實驗結(jié)果暗示螢光酶的活性較低是由于螢光酶可溶性蛋白含量少造成的。利用麥胚系統(tǒng)(用抗At

13、Fes1A抗體封閉麥胚中的AtFes1A蛋白或在麥胚中添加AtFes1A蛋白)檢測變性螢光酶的復性情況。實驗結(jié)果顯示，AtFes1A的存在對螢光酶的復性沒有顯著的影響，說明，在體外的實驗中，AtFes1A不能影響分子伴侶機器的功能。
　　總之，AtFes1A是新發(fā)現(xiàn)的，影響細胞質(zhì)HSP70穩(wěn)定性和影響變性底物復性的，植物耐熱相關基因。
　　本文主要創(chuàng)新點:
　　在國際上首次報道了擬南芥 AtFes1A基因是植物耐熱性相