1、熱激蛋白HSP70通過ATPase循環(huán)完成其功能。多種蛋白及輔助分子伴侶參與HSP70的ATPase循環(huán)，如J蛋白和底物能夠刺激HSP70水解ATP生成ADP，而ADP脫離HSP70則需要核苷酸交換因子(Nucleotide Exchange Factors，NEFs)的協(xié)助，因此，NEFs是HSP70分子伴侶體系中的一類關鍵輔助因子。目前，NEFs的研究多集中于原核生物(大腸桿菌中的GrpE)、酵母(Fes1p、Sse1p)和哺乳動物

2、(Bag-1、HspBP1)中，有關植物NEFs的研究尚未見報道。為此，作者對酵母Fes1基因在擬南芥中的同源物進行了研究。
　　擬南芥基因組中存在三個Fes1基因的同源物，它們都歸屬于ARM(Armadillo repeat)蛋白家族。作者將它們命名為AtFes1A(At3g09350)、AtFes1B(At3g53800)、AtFes1C(At5g02150)。Real-Time PCR實驗證實，在這三個成員中，AtFes1A

3、是高溫誘導下表達量最高的一個，所以作者主要研究了AtFes1A基因。對AtFes1A的定位和表達特性進行研究，發(fā)現AtFes1A是一個定位在細胞質中的，受高溫誘導表達的蛋白。作者自ABRC訂購了AtFes1A基因的T-DNA插入突變體(salk-021784和salk-012416)，對AtFes1A基因的功能進行研究。最后，作者以熱敏感的北美螢火蟲螢光酶作為靶標蛋白，研究了AtFes1A基因缺失導致擬南芥熱敏感的原初起因。
　　

4、主要實驗結果如下:
　　1.擬南芥基因組中存在三個Fes1的同源基因:AtFes1A、AtFes1B和AtFes1C。AtFes1A是三個成員中高溫誘導表達最高的一個基因。在Fes1基因缺失酵母中導入高拷貝質粒pYX242攜帶的AtFes1A基因的cDNA序列，發(fā)現酵母的熱敏感表型基本得到恢復，說明在耐熱方面，AtFes1A具有與酵母Fes1相似的功能。
　　為確定AtFes1A基因的表達特性，作者檢測了該基因在高溫、低溫、

5、干旱、NaCl脅迫下的表達水平。實驗結果表明，AtFes1A基因的表達受高溫誘導強烈表達，在低溫和干旱脅迫下表達稍有上調，NaCl不能誘導AtFes1A基因的表達。利用農桿菌侵染的方法，將含有AtFes1A基因的cDNA序列和GFP基因的融合基因轉化擬南芥，GFP熒光分析發(fā)現:GFP在保衛(wèi)細胞和原生質體的細胞質中表達，說明AtFes1A基因定位在細胞質中。
　　為檢測AtFes1A蛋白能否加速ADP脫離從而提高HSP70蛋白的AT

6、Pase活性，作者利用孔雀綠-鉬酸銨分光光度法進行了穩(wěn)態(tài)的ATPase實驗，通過檢測 HSP70水解ATP產生無機磷的速度來判斷AtFes1A是否對HSP70具有刺激作用。實驗結果表明，高濃度或低濃度的AtFes1A對HSP70的ATPase活性都沒有明顯的影響，說明AtFes1A可能不具有刺激ADP加速脫離HSP70的功能。
　　2.自 ABRC訂購了AtFes1A基因的T-DNA插入突變體(salk-021784和salk-0

7、12416)。通過PCR及測序對T-DNA插入 AtFes1A基因的位置進行鑒定。salk-021784和salk-012416突變體中T-DNA分別插入AtFes1A基因的第六外顯子和第五內含子上，突變體的純合子中檢測不到AtFes1A基因的轉錄產物和蛋白。獲得耐熱性實驗表明，與野生型相比，突變體在下胚軸延伸時期和幼苗時期都有明顯的獲得耐熱性缺陷，突變體種子萌發(fā)時期的耐熱性也明顯降低。突變體 salk-021784的互補實驗表明，At

8、Fes1A基因的表達能夠基本修復突變體的熱敏感表型。以上結果充分說明，突變體的熱敏感表型確實是由于AtFes1A基因敲除引起的。
　　3.為研究AtFes1A基因突變導致擬南芥熱敏感的原因，作者檢測高溫處理后，與耐熱相關的HSPs(HSP70、HSP101、sHSP classI和sHSP classII)基因和Hsfs(HsfA2和HsfB1)基因轉錄本的表達情況。Northern雜交結果顯示，與野生型相比，突變體salk-02

9、1784中HSPs和Hsfs基因的轉錄本水平較高。為驗證實驗結果的可靠性，作者利用Real-Time PCR對突變體(salk-021784和salk-012416)中耐熱相關的HSPs和Hsfs基因的轉錄本進行了檢測，所得結果Northern雜交的結果一致。以上結果充分說明，AtFes1A基因缺失導致耐熱相關的熱激蛋白基因的轉錄本升高。因此，AtFes1A是熱激蛋白信號轉導的負調控因子。
　　HSP70的高表達能夠抑制其他熱激蛋

10、白的表達。在salk-021784中，HSP70以及其他的一些熱激基因的轉錄本都上調，HSP70的高表達并沒有起到抑制作用。因此，作者檢測了salk-021784突變體中HSP70蛋白水平的表達。結果發(fā)現，與野生型相比，突變體中的HSP70的蛋白含量并沒有因為其轉錄本的升高而升高，而是明顯低于野生型中的。本研究首次報導了AtFes1A能夠影響HSP70的穩(wěn)定性。
　　4.作者利用western-blotting雜交檢測了熱激后，s

11、alk-021784和野生型擬南芥中全蛋白的泛素化程度。Western-blotting雜交結果表明，與野生型相比，salk-021784突變體中有更多的變性蛋白底物被標記了泛素分子，突變體中有更多的變性蛋白被蛋白酶降解。
　　為更進一步的研究擬南芥熱敏感的原因，作者構建了番茄線粒體小分子熱激蛋白 LeHSP23.8啟動子驅動的螢光酶基因的植物表達載體，利用農桿菌侵染法轉化salk-021784和野生型擬南芥。轉螢光酶基因擬南芥在

12、38℃適應2h以激活螢光酶的表達(熱激啟動子驅動)，隨后45℃高溫處理2h滅活螢光酶，放置在培養(yǎng)箱中恢復，檢測恢復不同時間的螢光酶的活力。實驗結果發(fā)現，與野生型中的螢光酶相比，突變體中的螢光酶的復性程度明顯較低。此外，作者還利用western-blotting檢測了恢復不同時間的可溶性的螢光酶的水平。實驗結果顯示，在突變體中的可溶性螢光酶的含量較低，此實驗結果暗示螢光酶的活性較低是由于螢光酶可溶性蛋白含量少造成的。利用麥胚系統(tǒng)(用抗At

13、Fes1A抗體封閉麥胚中的AtFes1A蛋白或在麥胚中添加AtFes1A蛋白)檢測變性螢光酶的復性情況。實驗結果顯示，AtFes1A的存在對螢光酶的復性沒有顯著的影響，說明，在體外的實驗中，AtFes1A不能影響分子伴侶機器的功能。
　　總之，AtFes1A是新發(fā)現的，影響細胞質HSP70穩(wěn)定性和影響變性底物復性的，植物耐熱相關基因。
　　本文主要創(chuàng)新點:
　　在國際上首次報道了擬南芥 AtFes1A基因是植物耐熱性相