1、第一部分小鼠肝臟部分熱缺血再灌注損傷對肝臟miR-155表達的影響
　　目的：探討小鼠肝臟部分熱缺血再灌注損傷對缺血肝組織miR-155表達的影響。
　　方法：取野生型 C57BL/6（WT）小鼠，將其隨機分為兩組：假手術組及手術組，每組20只，建立肝臟部分熱缺血再灌注損傷模型。假手術組（sham），不阻斷肝臟左葉、中葉血流，其余所有操作同手術組；手術組(I/R)，阻斷肝臟左葉、中葉血流1小時后，松開血管夾，開放血流，進行再

2、灌注。缺血1小時再灌注6小時后，評估小鼠存活率，并采集全血血漿檢測谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase, ALT）及谷草轉氨酶（aspertate aminotransferase, AST）水平以評估肝功能和缺血肝臟標本行HE染色，評價肝臟損傷程度，并且根據(jù)Suzuki’s標準，將肝臟損傷情況半定量進行統(tǒng)計學分析。通過TaqMan探針對肝組織進行逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real-t

3、ime polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測缺血再灌注損傷對miR-155表達的影響。結果：小鼠缺血1小時再灌注6小時后，兩組小鼠存活率均達95％以上，可以達到實驗要求。小鼠肝臟經歷部分熱缺血再灌注損傷后，出現(xiàn)明顯的肝功能損害，手術組ALT和AST比假手術組明顯升高（P<0.0001）。肝臟損傷病理顯示：假手術組，小鼠肝組織結構基本正常，小葉中央靜脈，肝細胞索結構清晰，肝臟無淤血，細胞無變性壞死，肝竇

4、排列整齊，未見炎性細胞浸潤。手術組小鼠肝臟經歷1小時缺血6小時再灌注后，可見肝臟明顯淤血，肝細胞索紊亂排列，不同程度的水腫變性和空泡狀變，可見大量片狀壞死灶，伴有炎性細胞浸潤。與假手術組相比，手術組Suzuki’s評分顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.0001）。與假手術組相比較，手術組小鼠肝臟缺血再灌注后損傷肝臟組織中miR-155的表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結論：我們成功建立了小鼠部分熱缺血再

5、灌注損傷模型，缺血再灌注損傷增加肝臟miR-155的表達。
　　第二部分 miR-155缺失減輕小鼠肝臟部分熱缺血再灌注損傷與Kupffer細胞有關
　　目的：探討miR-155缺失是否通過調節(jié)Kupffer細胞進一步減輕小鼠肝臟部分熱缺血再灌注損傷。
　　方法：采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）行microRNA-155基因敲除（miR-155-/-）小鼠鑒定。將小鼠分

6、為四組:（1）WT小鼠對照組：WT小鼠于手術前24小時尾靜脈注射與實驗組小鼠等量的磷酸鹽緩沖液，（2）miR-155-/-小鼠對照組：miR-155-/-小鼠于手術前24小時尾靜脈注射與實驗組小鼠等量的磷酸鹽緩沖液，（3）WT小鼠實驗組：WT小鼠于手術前24小時尾靜脈注射GdCl3溶液（10 mg/kg），（4）miR-155-/-小鼠實驗組：miR-155-/-小鼠于手術前24小時尾靜脈注射 GdCl3溶液（10 mg/kg）。對各組

7、小鼠進行肝臟部分熱缺血再灌注損傷手術，缺血1小時再灌注6小時后，采集全血血漿檢測ALT及AST水平以評估肝功能，將缺血肝臟標本行HE染色，評價肝臟損傷程度，并且根據(jù)Suzuki’s標準，將肝臟損傷情況半定量進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：WT小鼠陽性條帶為465bp，miR-155-/-小鼠陽性條帶為600bp。經尾靜脈注射GdCl3溶液的WT小鼠和miR-155-/-小鼠，ALT和AST水平顯著低于相應對照組小鼠轉氨酶水平，差異具有

8、統(tǒng)計學意義（P<0.0001）。并且，注射 GdCl3溶液的WT小鼠和miR-155-/-小鼠的轉氨酶水平沒有明顯差異，差異沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。而注射磷酸鹽緩沖液的WT小鼠，ALT和AST水平顯著高于注射磷酸鹽緩沖液的miR-155-/-小鼠的轉氨酶。兩實驗組肝臟病理學切片與相應的對照組相比，組織損傷明顯減弱。WT小鼠對照組術前24小時腹腔注射磷酸鹽緩沖液，肝臟經歷缺血再灌注后，可見肝臟明顯淤血，肝細胞索紊亂排列，不同程度的

9、水腫變性和空泡狀變，可見片狀壞死，伴有炎性細胞浸潤。miR-155-/-小鼠對照組，肝臟損傷較 WT小鼠對照組顯著減弱，Suzuki’s評分顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。實驗組，WT小鼠和miR-155-/-小鼠肝組織結構破壞減少，可見少許灶狀壞死及點狀細胞變性壞死，大部分的小葉中央靜脈及肝細胞索結構尚清晰，肝臟淤血減弱，肝竇排列整齊，炎性細胞浸潤明顯減少。
　　結論：miR-155缺失通過作用于 Kupffer細

10、胞，進一步減輕肝臟部分熱缺血再灌注損傷。
　　第三部分miR-155缺失通過調節(jié)Kupffer細胞極化減輕小鼠肝臟部分熱缺血再灌注損傷
　　目的：探討miR-155缺失減輕小鼠肝臟部分熱缺血再灌注損傷與其調節(jié)Kupffer細胞極化的關系。
　　方法：對WT小鼠及miR-155-/-小鼠做肝臟部分熱缺血再灌注損傷，缺血1小時再灌注6小時后,采集全血血漿檢測ALT及AST水平以評估肝功能,將缺血肝臟標本行HE染色，評價肝臟

11、損傷程度，并且根據(jù)Suzuki’s標準，將肝臟損傷情況半定量進行統(tǒng)計學分析。用TUNEL技術，檢測組織中肝細胞凋亡的情況。qRT-PCR檢測肝組織中炎性因子mRNA表達水平。密度梯度離心法分離小鼠肝臟中Kupffer細胞，流式細胞術檢測肝臟缺血再灌注損傷后 Kupffer細胞的表型及分型差異。提取 WT小鼠及miR-155-/-小鼠腹腔巨噬細胞，并貼壁純化，將細胞分4組：A組：WT小鼠腹腔巨噬細胞未刺激組，B組：miR-155-/-小鼠

12、腹腔巨噬細胞未刺激組，C組：WT小鼠腹腔巨噬細胞+ LPS（50ng/ml）刺激24小時，D組：miR-155-/-小鼠腹腔巨噬細胞+ LPS（50ng/ml）刺激24小時。收集每組細胞，流式檢測腹腔巨噬細胞表型及分型的差異；ELISA檢測腹腔巨噬細胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-10濃度。Transwell共培養(yǎng)研究 Kupffer細胞和巨噬細胞對肝細胞凋亡的影響。
　　結果：miR-155-/-小鼠組ALT和AST水平明顯低于WT

13、小鼠組。肝臟組織病理學切片顯示：與WT小鼠組相比，miR-155-/-小鼠組肝臟組織壞死區(qū)域明顯減小，淤血也較少，肝組織結構破壞明顯減弱。WT小鼠組肝組織淤血明顯增強，肝細胞索嚴重破壞，可見多個片狀壞死區(qū)域。與WT小鼠組相比，miR-155-/-小鼠組Suzuki’s評分顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.001），并且凋亡的肝臟細胞也顯著減少（P<0.05）。缺血再灌注損傷后，兩組小鼠肝臟中炎性因子的表達水平均明顯升高，miR-15

14、5-/-小鼠肝臟TNF-α的表達水平明顯低于WT小鼠，而miR-155-/-小鼠肝臟IL-10的表達水平明顯高于WT小鼠。肝臟缺血再灌注后，miR-155-/-小鼠組Kupffer細胞CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達水平明顯低于WT組小鼠，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。miR-155-/-小鼠組，M1型（CD11c+CD206-） Kupffer細胞較 WT組明顯減少，而 M2型（CD11c-CD206+）Kupffer較WT

15、組卻明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。分離純化的腹腔巨噬細胞純度>90%，可以滿足實驗需要。無LPS刺激組（PBS孵育組），miR-155-/-小鼠來源的腹腔巨噬細胞CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達明顯低于WT小鼠來源的巨噬細胞，差異具有統(tǒng)計學意義（CD80 P<0.01；CD86 P<0.05; MHC-ⅡP<0.05）。經LPS刺激后，兩種小鼠來源的巨噬細胞CD80、CD86、CD40和MHC-Ⅱ的表達均明顯升高，但

16、是，miR-155-/-小鼠來源的腹腔巨噬細胞 CD80、CD86、CD40和MHC-Ⅱ的表達水平與WT小鼠組相比明顯降低，差異顯著（CD80 P<0.01；CD86 P<0.05; CD40 P<0.01；MHC-ⅡP<0.05）。無LPS刺激組，miR-155-/-小鼠來源的腹腔巨噬細胞M1型（CD11c+CD206-）細胞比例顯著低于WT小鼠組（P<0.01），而其M2型（CD11c-CD206+）細胞比例卻顯著高于WT小鼠組（P

17、<0.05）。經LPS刺激后，兩種小鼠來源的巨噬細胞 M1型細胞比例均升高，M2型細胞比例均降低。但是，miR-155-/-小鼠組M1型細胞比例明顯低于WT小鼠組相比，M2型細胞比例明顯高于WT小鼠組，差異具有統(tǒng)計學意義（M1 P<0.05，M2 P<0.01）。LPS刺激后，巨噬細胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-10濃度均明顯升高，miR-155-/-小鼠組巨噬細胞培養(yǎng)上清中TNF-α的濃度明顯低于 WT小鼠組，而 miR-155-/-

18、小鼠組巨噬細胞培養(yǎng)上清中 IL-10的濃度明顯高于WT小鼠組，差異具有統(tǒng)計學意義（P值均小于0.05）。巨噬細胞和Kupffer細胞加速肝細胞凋亡；miR-155-/-小鼠來源的Kupffer細胞較 WT小鼠來源的Kupffer細胞對肝細胞促凋亡作用明顯減弱，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結論：miR-155缺失可以通過調節(jié)Kupffer細胞，抑制其向M1型分化，而促進其向M2型分化，減少炎性因子TNF-α分泌，而促進