1、本研究分為以下三部分： 第一部分： 目的：探討口腔黏膜細(xì)胞的培養(yǎng)方法，為進(jìn)一步以口腔黏膜細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化尿道提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：體外分離兔口腔黏膜細(xì)胞，取部分細(xì)胞與經(jīng)絲裂霉素滅活的3T3(i3T3)成纖維細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長(zhǎng)增殖情況。以非共培養(yǎng)的口腔黏膜細(xì)胞作為對(duì)照組。同時(shí)，對(duì)體外培養(yǎng)獲得的口腔黏膜細(xì)胞進(jìn)行廣譜角蛋白抗體(AE1/AE3)和K19免疫熒光染色鑒定；流式細(xì)胞儀檢測(cè)

2、第2代共培養(yǎng)細(xì)胞的AE1/AE3陽(yáng)性細(xì)胞百分比，細(xì)胞計(jì)數(shù)及MTT測(cè)定以判斷細(xì)胞增殖能力。 結(jié)果：與滅活的3T3成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的口腔黏膜細(xì)胞形態(tài)均一，有較強(qiáng)的增殖能力，可傳代至7～8代。非共培養(yǎng)的口腔黏膜細(xì)胞則形態(tài)多樣，傳至第2代時(shí)，即開(kāi)始出現(xiàn)老化，細(xì)胞貼壁及增殖能力均明顯減弱。免疫熒光染色顯示，體外培養(yǎng)獲得的口腔黏膜細(xì)胞AE1/AE3免疫熒光染色陽(yáng)性，40％細(xì)胞K19染色陽(yáng)性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，第2代共培養(yǎng)的口腔黏膜細(xì)胞

3、AE1/AE3陽(yáng)性細(xì)胞百分比＞95％。接種于i3T3細(xì)胞上的口腔黏膜細(xì)胞傳至第3代時(shí)可獲得細(xì)胞數(shù)量在20×106以上，完全可滿(mǎn)足組織工程對(duì)細(xì)胞數(shù)量的要求。 結(jié)論：口腔黏膜細(xì)胞在有滅活的3T3成纖維細(xì)胞存在時(shí)可成功培養(yǎng)和擴(kuò)增，為進(jìn)一步將其作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化尿道奠定了良好的基礎(chǔ)。 第二部分： 目的：探討以兔口腔黏膜細(xì)胞為種子細(xì)胞與同種異體膀胱黏膜下脫細(xì)胞基質(zhì)(bladderacellularmatrixgra

4、ft，BAMG)復(fù)合，構(gòu)建組織工程化黏膜的方法。 方法：取雄性新西蘭大耳白兔(體重0.3～0.5kg)口腔黏膜組織，分離獲得口腔黏膜細(xì)胞，在有滅活的3T3細(xì)胞的培養(yǎng)皿上進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，于接種后第二天開(kāi)始每天定點(diǎn)倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)觀察生長(zhǎng)增殖情況，并行免疫熒光組織化學(xué)染色鑒定。取同種異體兔膀胱，經(jīng)脫細(xì)胞處理制成BAMG，隨機(jī)取小塊組織行HE染色，觀察脫細(xì)胞效果，將培養(yǎng)獲得的第二代口腔黏膜細(xì)胞種植于BA

5、MG上，通過(guò)HE染色及掃描電鏡觀察口腔黏膜細(xì)胞與BAMG的復(fù)合狀況。 結(jié)果：倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在有3T3細(xì)胞存在時(shí)，口腔黏膜細(xì)胞可傳代至7～8代，其細(xì)胞形態(tài)均一，功能良好；細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示口腔黏膜細(xì)胞于第8天開(kāi)始呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，至第14天達(dá)到峰值。培養(yǎng)的口腔黏膜細(xì)胞行免疫熒光染色，顯示出綠色熒光。BAMG經(jīng)脫細(xì)胞處理后，隨機(jī)取材行HE染色觀察，未見(jiàn)有細(xì)胞存在，脫細(xì)胞效果良好。將采用3T3滋養(yǎng)層培養(yǎng)獲得的口腔黏膜細(xì)胞，種植在BAM

6、G上，通過(guò)HE染色，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)兩者復(fù)合良好。 結(jié)論：兔口腔黏膜細(xì)胞可在體外成功培養(yǎng)、擴(kuò)增，與同種異體BAMG復(fù)合后生長(zhǎng)良好，為進(jìn)一步利用此復(fù)合物構(gòu)建組織工程化尿道奠定了基礎(chǔ)。 第三部分： 目的：探討以兔口腔黏膜細(xì)胞為種子細(xì)胞與同種異體膀胱黏膜下脫細(xì)胞基質(zhì)(bladderacellularmatrixgraft，BAMG)復(fù)合，構(gòu)建組織工程化尿道的可行性.。 方法：取雄性新西蘭大耳白兔(體重0.3～0

7、.5kg)口腔黏膜組織，分離獲得口腔黏膜細(xì)胞。將口腔黏膜細(xì)胞與經(jīng)絲裂霉素滅活的3T3(i3T3)成纖維細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。取同種異體兔膀胱，經(jīng)脫細(xì)胞處理制成BAMG，隨機(jī)取小塊組織行HE染色，觀察脫細(xì)胞效果，然后將與i3T3細(xì)胞共培養(yǎng)獲得的第二代口腔黏膜細(xì)胞種植于BAMG上，通過(guò)HE染色及掃描電鏡觀察口腔黏膜細(xì)胞與BANG的復(fù)合狀況。24只雄性兔隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組2組，距尿道外口2.0cm剝離實(shí)驗(yàn)兔尿道黏膜(2.0cm×0.8cm)。切

8、取實(shí)驗(yàn)組兔口腔黏膜組織(1.0cm×0.4cm)，分離出口腔黏膜細(xì)胞，在有滅活的3T3細(xì)胞的培養(yǎng)皿上進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，將培養(yǎng)獲得的第二代口腔黏膜細(xì)胞種植于BAMG(2.2cm×1.0cm)上，植入實(shí)驗(yàn)組兔尿道缺損區(qū)域；對(duì)照組單純采用無(wú)細(xì)胞植入的BAMG修復(fù)尿道。分別于術(shù)后1、2、6個(gè)月，觀察排尿情況，行尿道造影，確定有無(wú)狹窄；隨后處死實(shí)驗(yàn)兔，取修復(fù)段尿道黏膜行組織學(xué)檢查和免疫組化檢查。 結(jié)果：采用3T3滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)獲得的口腔黏膜細(xì)

9、胞形態(tài)均一，功能良好；BAMG經(jīng)脫細(xì)胞處理后，隨機(jī)取材行HE染色觀察，未見(jiàn)有細(xì)胞存在，脫細(xì)胞效果良好。通過(guò)形態(tài)學(xué)，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)口腔黏膜細(xì)胞與BAMG兩者復(fù)合良好。實(shí)驗(yàn)組兔均未發(fā)生與手術(shù)相關(guān)性死亡，于術(shù)后1、2、6個(gè)月，傷口愈合正常，排尿通暢，無(wú)尿瘺發(fā)生，修復(fù)段尿道大體形態(tài)，組織學(xué)檢查和尿道造影顯示帶細(xì)胞修復(fù)的尿道形態(tài)完整，清晰寬敞，無(wú)狹窄發(fā)生；術(shù)后6個(gè)月，口腔黏膜細(xì)胞的鱗狀上皮結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，與尿道的移行上皮界限明顯，行P63抗體染色

10、，修復(fù)段尿道基底層細(xì)胞染色陽(yáng)性。對(duì)照組12只兔中有兩只在術(shù)后近1個(gè)月時(shí)因感染死亡，另有兩只于術(shù)后1月時(shí)發(fā)生尿瘺，其余8只均發(fā)生不同程度的排尿困難，尿線(xiàn)變細(xì)或呈滴瀝狀，術(shù)后1、2、6個(gè)月，尿道造影顯示修復(fù)段尿道有狹窄發(fā)生；大體形態(tài)顯示尿道瘢痕性狹窄，黏膜蒼白僵硬；組織學(xué)檢查顯示修復(fù)段尿道無(wú)明顯移行上皮細(xì)胞形成，且2只兔黏膜及黏膜下發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。 結(jié)論：兔口腔黏膜細(xì)胞與同種異體BAMG復(fù)合后，可成功用于尿道缺損的修復(fù)，構(gòu)建組織