1、免疫球蛋白結合分子(Ig-binding proteins,IBP)是一類表達于細菌表面的能與宿主免疫球蛋白特定部位結合的蛋白，能調節(jié)宿主對細菌的免疫反應，是細菌重要致病因子之一。研究最多的IBP主要有3種：金黃色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal proteinA,SpA)、鏈球菌(C和G群)蛋白G (Streptococcal protein GSpG) 和部分大消化鏈球菌表面的蛋白L (Peptostreptococcu

2、s magnus protein L,PpL)。這三種IBP分子的胞外部分均含由若干重復的序列高度同源的Ig結合結構域。在Ig結合特性上，這三種分子均具有各自的特點和局限。因此，通過對這三種分子進行重組，獲得具有新的結合活性的重組IBP分子，已成為IBP研究的方向之一。 在以前的研究中，我們將SpA和PpL的單個Ig結合結構域DNA片段隨機拼接，再應用噬菌體展示技術將這些拼接后的分子表達于噬菌體表面，構建了SpA和PpL的單結

3、構域隨機組合分子噬菌體展示文庫。以人Ig(包括IgG、IgA、IgM及IgE)為誘餌對文庫進行親和篩選，得到了一類篩選后文庫中的優(yōu)勢克隆，即由PpL的B3結構域與SpA的D、A、B、C結構域(主要為D)間隔排列組成的新型進化IBP形式(MDPL-MDPA)n。由于VH3重鏈和K輕鏈在IgG、IgA、IgM及IgE上均有分布，因此，我們推斷，B3結構域和D結構域的間隔排列使該類分子具有對Ig的VH3重鏈和K輕鏈的雙位點結合，從而使親和力明

4、顯提高而成為優(yōu)勢克隆。為驗證我們提出的這一推斷，本課題以LD3和LD5作為(MDPL-MDPA)n結構形式的代表分子，對LD3/5分子對各類Ig和Ig片斷及scFv進行結合和競爭實驗，同時比較LD3／5與SpA和PpL的差異，并應用SPR技術對LD3/5結合各類Ig的動力學和親和性進行研究，證實了進化免疫球蛋白結合分子LD3/5具有對V<,H>3和V<,κ>的雙位點協(xié)同結合特性。 一、(MDPL-MDPA)n分子的結合特性的定

5、性和定量研究 本課題以LD3和LD5作為(MDPL-MDPA)n的代表性分子，首先對LD3/5進行原核表達和純化。SpA和4L(由四個 PpL的B3結構域組成)作為LD3/5的來源蛋白，用作結合特性的對照和競爭實驗時的競爭物。 人IgG以木瓜蛋白酶切獲得Fab、Fc，對Fab、Fc及IgG、IgM、IgA及LD5蚩白進行生物素標記。三種scFv的表達質粒由荷蘭Sanquil實驗室Dr．Jan Voorberg提供，將

6、質粒轉化TG1進行誘導表達。 以相同量的LD3、LD5、4L、SpA包板，用生物素標記的IgG、IgM、IgA及Fab、Fc分別進行結合EIASA。結果表明，對IgG的結合性，SpA>LD5<'-> LD3>4-L；對Fc的結合性，SpA>LD5>LD3，4L不結合；而對 IgM、IgA 和Fab的結合性則呈現(xiàn)一致的趨勢，即LD5>LD3>4L>SpA。由于IgM、Ign和Fab抗體結構的共同特點是都具有V<,H>3重鏈和κ輕

7、鏈，而均沒有可以與IBP分子結合的Fc段，因此可以看出，LD3/5相對于SpA和4L的結合優(yōu)勢表現(xiàn)在與含有V<,H>3和V<,κ>位點的Fab的結合上，而對IgG-Fc的親和性并無增高。這一結果支持我們的推斷即 LD3/5具有對Ig的V<,H>3和V<,κ>的雙位點結合特性，但由于以上的IgM、IgA和Fab均為血清多克隆組成，含有多種V<,H>基因和輕鏈型別的組合，因此這一結果不能成為V<,H>3和V<,κ>的雙位點結合的直接證據。通

8、過Western Blot和Dot Blot的方法對EILSA的結果進行了驗證。在Western Blot中，以相同量的LD3、LD5、4L、SpA進行SDS-PAGE，轉膜后與生物素標記的各種Ig結合，發(fā)現(xiàn)對LD3、LD5、4L、SpA對IgG、Fab、Fc的結合強弱關系與ELISA一致，而在對IgM、IgA的結合上，LD3/5的結合優(yōu)勢不明顯，可能由于SDS-PAGE電泳過程和膜固相化改變了蛋白的構象，使LD3/5的結合特性受影響。

9、在Dot Blot實驗中，以相同量的LD3、LD5、4L、SpA及BSA點膜，與生物素標記的各種Ig結合。結果與Western Blot相似。 基因工程scFv抗體具有單一的VH基因和輕鏈型別的組合，我們獲得了三種scFv抗體，KM36 (V<,H>3-V<,λ>3)、KM38(V<,H>3-V<,κ>Ⅰ)和KM41(V<,H>1-V<,κ>Ⅲ)，用這三種scFv抗體包板，與生物素標記的LD5結合，結果顯示LD5對這三種scF

10、v的親和性KM38>KM41>KM36。用這三種scFv抗體以生物素標記的LD5進行Western Blot檢測，得到與ELISA同樣的結果。該結果為LD3/5分子對V<,H>3和V<,κ>雙位點結合特性提供了直接證據。 我們應用SPR技術對LD3、LD5、4L、SpA與Ig結合的動力學和親和力進行了定量分析，測定了LD3/5及4L、SpA對各種Ig分子的結合率常數(shù)k<,a>，解離率常數(shù)k<,d>及平衡解離常數(shù)K<,D>，本實

11、驗在復旦大學遺傳所使用 Biacore3000儀器進行。以IgG、IgM、IgA分別標記芯片，與LD3、LD5、4L、SpA分別結合，BIAevaluation 3.0軟件分析結果，從得到的K<,D>看出，LD3/5對IgM和IrA的親和性較4L高出1到8倍，較SpA則優(yōu)勢更明顯。且對IgM比對IgA的結合優(yōu)勢更為明顯，與ELISA結果一致。該結果對LD3/5的結合特性分析提供了定量的支持。 二、LD3/5、4L、SpA結合各

12、類Ig分子的競爭抑制實驗 結合實驗的結果說明LD3/5分子與4L和SpA相比，具有對Ig-Fab的高親和性。而這種現(xiàn)象可有兩種解釋，一是LD3/5對V<,H>3和V<,κ>兩個位點結合的單純相加效應，這種效應的結合應該能被4L和SpA的聯(lián)合所有效的抑制；另一種解釋，即本課題所提出的科學推斷，LD3/5分子具有對V<,H>3和V<,κ>的雙位點結合協(xié)同增強機制，從而使LD3/5對Ig-Fab的親和性明顯提高，而4L和SpA聯(lián)合不

13、能有效的抑制這種協(xié)同作用。因此，進行競爭性結合實驗，是本課題驗證LD3/5 對 V<,H>3和V<,κ>雙位點結合的關鍵所在。 競爭抑制實驗以兩種方案進行，分別是以IBP分子包板和以Ig分子包板。在第一種方案中，以生物素標記的Ig和各種抑制蛋白(4L、LD3、LD5、SpA、4L+SpA)先作用，再移入4L、LD3、LD5、SpA包被條排孔反應；另一種方案則用lg分子包板，同時加入生物素標記的LD5和各種抑制蛋白反應。這兩種競

14、爭實驗的結果均表明，LD3/5能有效的抑制4L對IgM、IgA、IgG-Fab的結合和SpA對IgG和Fc的結合，LD3/5能100％的抑制自身對IgM、IgA、IgG-Fab的結合，而更為重要的是，4L和4L+SpA在與LD3/5相同的濃度下只能抑制 50％-60％的LD3/5對IgM、IgA、IgG-Fab的結合，且繼續(xù)升高4L和4L+SpA的濃度，抑制百分比無明顯變化。這一結果有力的說明了LD3/5對IgM、IgA、IgG-Fab

15、的V<,H>3和V<,κ>的雙位點結合協(xié)同作用。 在LD5結合scFv的競爭抑制實驗中，雖然LD5對KM38的親和性較KM36和KM41高，但LD5對KM38的結合卻能有效地被4L及4L+SpA抑制。我們認為，由于基因工程scFv的V<,H>和V<,L>區(qū)是以連接肽相連，其V<,H>-V<,L>異二聚體的構象與天然Ig不同，使LD3/5對V<,H>3和V<,κ>的雙位點結合不能有效實現(xiàn)。這也說明了雙位點結合對抗體構象的嚴格要求

16、。 結論：本課題應用ELISA、Western Blot、Dot Blot和SPR等方法證實了新型進化免疫球蛋白結合分子LD3/5具有對IgG-Fab、IgM和IgA明顯提高的親和性，并且首次證實了由PpL的B3結構域和SpA的D結構域間隔重組的LD3/5分子具有對V<,H>3和V<,κ>的雙位點協(xié)同結合特性。這類分子在免疫抗體檢測方面具有應用前景，將提高對IgM、IgA的檢測敏感性，有助于HIV、HCV等重大傳染病的早期診斷