1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為內(nèi)膜系統(tǒng)的核心，具有參與蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運，糖原分解和脂類、膽固醇合成等功能。肝臟中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還參與內(nèi)源的疏水代謝產(chǎn)物和異源物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的失調(diào)能引起細胞的功能異常和一系列疾病。為了深入了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在肝臟中所發(fā)揮的重要功能，我們對C57BL/6J小鼠和成人健康肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)組進行了研究。 作為人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃(Human liverproteome project HLPP)一部分，本研究采用了聯(lián)合提取細

2、胞器的策略，可以同時從同一個肝臟勻漿液中獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胞漿、線粒體、細胞膜和細胞核多種細胞器樣本。聯(lián)合提取細胞器，的技術策略一方面可以充分利用樣品，尤其是難以獲得的臨床樣本；另一方面可以有利于將來對來自同一勻漿液的各個亞細胞組分進行系統(tǒng)比較。 樣品的準備是組織來源的亞細胞組分分離的關鍵，本文首次對新鮮樣本、凍存液凍存樣本和直接凍存樣本提取的細胞器進行了比較，提出了一種備選的除新鮮組織之外的樣品準備方案，即凍存的肝勻漿液方式，該方

3、法尤其適合于不方便新鮮獲得的臨床樣本及滿足樣本建庫的需求。另外，我們通過綜合評價提出，直接凍存的肝臟組織所提取細胞器不適合用于表達譜研究。 在獲得了高度富集內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分的基礎上，我們分別構(gòu)建了C57BL/6J小鼠和成人健康肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)表達譜。由于肝臟樣本的復雜性和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自身組成的多樣性，我們有必要選擇一種適合分離復雜樣本的高通量蛋白質(zhì)鑒定技術路線。SDS-PAGE結(jié)合nano-LC-ESI-MS/MS技術策略，是一種被廣泛

4、采用的通量化蛋白質(zhì)組技術路線。本研究在選用該技術策略基礎上，同時引入了質(zhì)譜分段掃描的分離模式(Gas phase fractionation，GPF)，該模式根據(jù)m/z比在肽段水平上對其進行第三維的分離。結(jié)果表明，分段掃描的引入分別從肽段和蛋白質(zhì)水平上增加了50％的鑒定率，從而有效擴展了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)組。另外對分段掃描所捕捉到的電荷性質(zhì)進行分析，發(fā)現(xiàn)980-1600波段能夠有效地捕捉到容易在全波段掃描丟失掉的單電荷肽段。 在高通

5、量的3-D蛋白質(zhì)鑒定技術路線基礎上，采用反庫評價方法對蛋白質(zhì)可信度進行評估，存大于95％置信度、雙肽段以上匹配的高可信度卡值的標準下，分別有1065、921種蛋白質(zhì)在小鼠肝臟滑面、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中得到鑒定； 1254和920種蛋白質(zhì)在成人肝臟滑面和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中得到鑒定。采用本實驗室根據(jù)Gene Ontology(http：//www．ebi．a(chǎn)c．uk/ego/)開發(fā)的軟件GOfact工具對小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)表達譜數(shù)據(jù)進行功能注

6、釋，結(jié)果顯示除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所特定的功能模塊得到了顯著富集外，我們很意外的發(fā)現(xiàn)滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相對富集了鈣結(jié)合蛋白質(zhì)。將我們的數(shù)據(jù)與文獻報道的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)組(大鼠分泌途徑蛋白質(zhì)組，1237個蛋白質(zhì))進行比較，兩者共有662個蛋白質(zhì)，分別占自身和大鼠數(shù)據(jù)的53.5％和42.5％。推測這部分共有的蛋白質(zhì)可能是組成型表達蛋白質(zhì)，對維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的基本生理學功能發(fā)揮重要作用。Gene Ontology超幾何分析證明了這個推測。分別將兩者共有和特有的蛋白質(zhì)進行進行

7、GOfact超幾何分布分析，結(jié)果表明結(jié)構(gòu)分析活性和維持細胞穩(wěn)態(tài)的蛋白質(zhì)在共有蛋白質(zhì)中顯著富集；而應激反應(壓力應激、生命物刺激應激和免疫應激)和基因表達調(diào)控功能模塊在特有蛋白質(zhì)中富集。提示共有蛋白質(zhì)相對富集了一些恒定表達的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，而特有蛋白質(zhì)則相對富集了一些調(diào)控型表達的蛋白質(zhì)或穿梭蛋白質(zhì)。 根據(jù)串聯(lián)質(zhì)譜的譜圖數(shù)對鑒定蛋白質(zhì)進行半定量，已經(jīng)成為目前廣泛采用的蛋白質(zhì)定量方法之一，在此采用了一種基于期望值最大化(EM)校正過質(zhì)譜

8、譜圖計數(shù)的方法對所鑒定的蛋白質(zhì)進行量化。然后采用spearman相關的方法對其分別在粗面、滑面和胞漿中的定量分布進行聚類。結(jié)果分別發(fā)現(xiàn)了一批與粗面、滑面和胞漿標志性蛋白共聚類的蛋白質(zhì)，根掘Swiss-Prot的定位注釋分析，除部分已知定位于該細胞器的蛋白質(zhì)，還有大量的未知定位信息的蛋白質(zhì)分布其中，包括217個數(shù)據(jù)庫中提示僅在轉(zhuǎn)錄水平檢測到的新蛋白質(zhì)。同時我們還意外的發(fā)現(xiàn)了4個與已知定位認識不相符的蛋白質(zhì)，分別是Nmi、Ifi35、Cdk

9、5和Drg1，數(shù)據(jù)顯示，該類蛋白質(zhì)在共聚類分析中以高可信度定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(相關系數(shù)大于0.95，p<0.05)中，而據(jù)數(shù)據(jù)庫和文獻報道這些蛋白質(zhì)定位于胞漿中。我們采用了熒光共定位的方法，首批驗證了Ifi35在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位。 本研究作為HLPP計劃中的一部分，首先對樣本保存方式及細胞器提取策略進行了系統(tǒng)的比較和評價，在此基礎上所形成的凍存肝臟勻漿液備選保存方法和細胞器聯(lián)合提取技術方案已成為中國人類肝臟蛋白質(zhì)計劃中亞細胞蛋白質(zhì)表達

10、譜構(gòu)建的標準操作規(guī)范(Standard operation procedure，SOP)。采用引入氣相分段掃描的三維(3-D)蛋白質(zhì)鑒定技術策略和高于國際通用的數(shù)據(jù)卡值標準(大于95％置信度、雙肽段以上匹配)，我們分別從6，152、6,935個非冗余肽段中獲得了921和1065個高信度蛋白質(zhì)。通過對這些蛋白質(zhì)的定量和聚類分析，發(fā)現(xiàn)了217可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的未知功能蛋白質(zhì)和4個與已知定位認識矛盾的蛋白質(zhì)，采用熒光共定位方法首批確證了If