1、迅速發(fā)展的石油工業(yè)帶給我們的不僅是巨大的經(jīng)濟(jì)效益,還包括日益嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。用于強(qiáng)化降解的微生物菌種通常是自然界篩選的混合菌群,組成比例在使用過程中容易發(fā)生變化,并可能在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)生競爭、抑制的情況。所以,利用遺傳工程技術(shù)獲得可用于提高整個(gè)降解效率的多功能基因工程菌意義重大。本研究以本實(shí)驗(yàn)室分離并保存的8株石油降解菌LY-1、LY-2、LY-3、LY-4、LY-5、LY-6、LY-7、LY-8為研究對(duì)象,進(jìn)行質(zhì)粒提取,獲得了對(duì)石油

2、降解非常重要的降解性質(zhì)粒(degradative plasmid),并成功的克隆出了鄰苯二酚2,3-雙加氧酶基因(c23O),并對(duì)此基因進(jìn)行了表達(dá)和功能研究。在質(zhì)粒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,得到的質(zhì)粒帶大于20 kb,對(duì)于大質(zhì)粒提取研究較少,所以運(yùn)用幾種質(zhì)粒提取方法進(jìn)行質(zhì)粒的抽提,從菌株LY-5中,提取出較為清晰的大質(zhì)粒。在經(jīng)鄰苯二酚誘導(dǎo)后LY-5菌株中檢測(cè)到了鄰苯二酚2,3雙加氧酶(CatO2ase)酶活,這表明LY-5菌株的細(xì)胞內(nèi)含有鄰苯二酚降解

3、路徑。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行初步降解功能研究發(fā)現(xiàn),該質(zhì)粒具有石油降解特性。查閱相關(guān)文獻(xiàn),查找質(zhì)粒上可能存在的降解性基因。確定要克隆的目的基因是c23O基因,在Genbank上查找此基因的同源序列,并設(shè)計(jì)引物,以菌株LY-5中提取的質(zhì)粒為模板,通過PCR的方法進(jìn)行基因克隆,得到了c23O基因并進(jìn)行測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。c23O基因序列全長924 bp,編碼307 aa,蛋白的分子量為34.86 kDa,理論等電點(diǎn)為5.35。編碼區(qū)G+C

4、含量為54.87 %,A+T含量為45.13 %,為典型的原核生物的堿基含量特征。c23O基因的氨基酸序列保守區(qū)預(yù)測(cè)表明與其匹配的保守區(qū)共有3個(gè),pfam00903；COG0346；COG2514。Pfam蛋白家族預(yù)測(cè)表明,該基因同屬于PF00903家族,分值：81.8,E-value：2.1e-21。從BlastP相似性搜索結(jié)果表明基因與惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的基因相似性達(dá)到99%。菌株LY-5的c23O

5、基因與已知產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)的c23O基因編碼基因編碼的多肽氨基酸序列相似性不高,與來源于假單胞菌屬的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)和惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的酶基因序列的相似性較高。將克隆得到的c23O基因構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-c23O,通過PCR、重組質(zhì)粒提取和雙酶切檢測(cè)證明重組載體構(gòu)建成功。通過IPTG誘導(dǎo)使c23O基因在大腸桿菌(Escherichi

6、a coli)中表達(dá),SDS-PAGE檢測(cè)獲得64 kDa左右的融合蛋白帶,大小與預(yù)期相符,說明它們已經(jīng)在大腸桿菌中表達(dá)。IPTG誘導(dǎo)3小時(shí),胞內(nèi)酶活性達(dá)到最高476.7 mu/ml。對(duì)胞外、胞內(nèi)、胞間質(zhì)總酶活進(jìn)行計(jì)算,得到最高酶活活性545 mu/ml。成功表達(dá)出鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活,且顯示其表達(dá)蛋白在表達(dá)宿主菌中主要以胞內(nèi)酶的形式存在。同時(shí),也證明了產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)的c23O基因能夠在原核生物中良好表達(dá)。