1、利用微生物技術去除環(huán)境中的有害物質是最為經(jīng)濟可行的環(huán)境修復方法。微生物對環(huán)境有機污染物的降解主要涉及氧化反應，而有O2參與的氧化反應往往會產(chǎn)生能夠損傷DNA、蛋白質和其他細胞組分的活性氧自由基(ROS)，影響細胞存活，從而降低微生物對環(huán)境有機污染物的降解能力和速率。類胡蘿卜素作為一種膜結合的抗氧化劑能夠保護細胞抵御氧化壓力。
　　 本文在課題組前期對一株咔唑降解菌——鞘氨醇桿菌XLDN2-5（Sphingobium yanoik

2、uyae XLDN2-5）進行全基因組測序和注釋的基礎上，分析預測了6個ORFs涉及類胡蘿卜素合成途徑，它們分別編碼牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶(GGPP synthase，CrtE)、八氫番茄紅素合成酶（phytoene synthase，CrtB）、八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene dehydrogenase，CrtI)、番茄紅素環(huán)化酶(lycopene cyclase，CrtY)、β-胡蘿卜素羥化酶（β-carotene hy

3、droxygenase，CrtZ）和酮酶(β-carotene ketolase，CrtW)，將此6個ORF分別命名為crtE、crtB、crtI、crtY、 crtZ和crtW。通過序列比對可知，這些基因與已報道的類胡蘿卜素合成相關基因有30-60％的相似性。但與已報道的大多數(shù)微生物體內(nèi)類胡蘿卜素合成基因的成簇排布方式不同，在鞘氨醇桿菌XLDN2-5中，除了crtY基因的終止密碼子與crtI基因的起始密碼子重疊并與crtB基因鄰近外，

4、其他類胡蘿卜素合成基因散布在基因組的其他位置。
　　 隨后，利用PCR擴增類胡蘿卜素合成相關基因，構建相應質粒，通過雙質粒共表達的方法將質粒轉入能夠積累不同類胡蘿卜素中間產(chǎn)物的Escherichia coli中，HPLC、HPLC-MS分析產(chǎn)物，從而驗證基因功能。結果表明，crtI基因編碼八氫番茄紅素脫氫酶，催化八氫番茄紅素(phytoene)脫氫生成番茄紅素(lycopene); crtY基因編碼番茄紅素環(huán)化酶，在番茄紅素的兩

5、端環(huán)化形成β-胡蘿卜素(β-carotene);crtZ基因編碼β-胡蘿卜素羥化酶，依次在β-胡蘿卜素兩端環(huán)上加一個羥基，經(jīng)僅在一個環(huán)上含有羥基的中間體β-cryptoxanthin，生成玉米黃質（zeaxanthin）;而crtE和crtB基因共同表達時卻未檢測到預期的產(chǎn)物——八氫番茄紅素，crtW基因也未顯示出β-胡蘿卜素酮酶的功能活性，不能將玉米黃質催化生成蝦青素（astaxanthin）。
　　 HPLC-MS分析來自鞘

6、氨醇桿菌XLDN2-5菌體的丙酮抽提物，可確定該菌主要積累玉米黃質。當共代謝咔唑(CA)和二苯并噻吩(DBT)時，菌體顏色從降解CA時的淺黃色變?yōu)樯铧S色，共代謝CA和苯并噻吩(BT)時的菌體顏色次之;菌體中積累的玉米黃質含量隨菌體對不同雜環(huán)化合物的降解而有極顯著的提高(CA＜CA+BT＜CA+DBT)。
　　 在鞘氨醇桿菌XLDN2-5降解CA、轉化BT和DBT的過程中，尤其是在共代謝CA和DBT時，利用氧化壓力敏感性探針DCF

7、H-DA檢測到菌體內(nèi)產(chǎn)生了大量的H2O2，菌體受到的氧化壓力遠高于葡萄糖培養(yǎng)的對照組;在持續(xù)降解雜環(huán)化合物的生長體系中，單位體積培養(yǎng)液內(nèi)的菌體量隨細胞氧化壓力的增加(G＜ CA＜BT＜DBT)而逐漸減少(G＞CA＞BT＞DBT)，多次添加雜環(huán)底物后，菌株XLDN2-5對雜環(huán)化合物的降解能力明顯減弱。同時，類胡蘿卜素合成關鍵酶——八氫番茄紅素脫氫酶基因(crtI)的表達水平隨著菌株對不同雜環(huán)化合物的降解而增加，且隨培養(yǎng)基內(nèi)DBT濃度的提高

8、而增加。相反，β-胡蘿卜素羥化酶基因(crtZ)的表達水平隨著菌株對不同種類或不同濃度的雜環(huán)化合物的降解而有明顯降低，且不隨菌體積累玉米黃質含量的變化而變化。八氫番茄紅素脫氫酶(CrtI)的高表達能夠保證玉米黃質前體——β-胡蘿卜素的積累。盡管β-胡蘿卜素羥化酶(CrtZ)表達水平降低，但最終會因其反應前體β-胡蘿卜素的增加而提高菌體內(nèi)玉米黃質的含量。
　　 總之，在降解雜環(huán)化合物的過程中，鞘氨醇桿菌XLDN2-5體內(nèi)產(chǎn)生的H2

9、O2水平及crtI基因的表達水平與等量菌體內(nèi)積累的玉米黃質的總量變化趨勢一致(CA＜CA+BT＜CA+DBT)，且類胡蘿卜素的積累能夠提高菌株生長量。這表明雜環(huán)降解與細胞內(nèi)氧化壓力的增加和類胡蘿卜素合成之間存在直接或間接的聯(lián)系。鑒于類胡蘿卜素物質的抗氧化作用和親脂性質，我們推測類胡蘿卜素的合成對雜環(huán)化合物的降解可能具有積極作用，一方面能夠作為抗氧化物清除部分ROS，另一方面還可作為一種親脂的物質通過占據(jù)細胞膜內(nèi)的位置減少生物異源物進入細

10、胞膜內(nèi)的自由空間，減小CA、BT和DBT等生物異源物與細胞膜的相互作用，從而減小雜環(huán)降解過程中產(chǎn)生的ROS對菌體帶來的細胞損傷，最終提高菌株XLDN2-5在環(huán)境中的存活率和持續(xù)且有效地降解雜環(huán)化合物的能力。
　　 此外，我們利用Illumina HiSeq2000對兩株咔唑降解假單胞菌——淺黃假單胞菌XLDN4-9(Pseudomonas luteola XLDN4-9)和施氏假單胞菌XLDN-R(Pseudomonas stu

11、tzeri XLDN-R)進行了全基因組測序。同時比較5株已測序的雜環(huán)化合物降解菌的基因組，并分析了以咔唑為唯一碳氮源生長的鞘氨醇桿菌XLDN2-5的蛋白質組，結果發(fā)現(xiàn)除了鞘氨醇單胞菌屬積累類胡蘿卜素外，雜環(huán)降解微生物還存在烷基過氧化氫還原酶(alkyl hydroperoxide reductase)、過氧化物酶(catalase)、谷胱甘肽(glutathione)/谷氧還蛋白(glutaredoxin)和硫氧還蛋白(thiored

12、oxin)等多種與抗氧化壓力相關的酶和蛋白質。
　　 根據(jù)本論文的研究結果可知，在降解雜環(huán)化合物的過程中，鞘氨醇桿菌XLDN2-5體內(nèi)產(chǎn)生大量的H2O2，其氧化壓力對細胞的損傷和對菌株生長的影響可能是降解菌不能持續(xù)降解雜環(huán)化合物，有機雜環(huán)化合物在環(huán)境中長期存在的主要原因。在雜環(huán)化合物降解過程中，XLDN2-5細胞內(nèi)積累了大量的玉米黃質，其含量隨菌體對雜環(huán)化合物的降解而產(chǎn)生H2O2等ROS的水平變化而變化，玉米黃質作為一種非酶類抗