1、RNAi技術在轉基因植物上的應用越來越廣,包括已經(jīng)允許商業(yè)化生產(chǎn)的轉基因植物中,但目前對RNAi轉基因植物的快速精確檢測技術相對滯后。本研究的目的在于建立基于DNA的RNAi轉基因植物快速精確的檢測體系,實現(xiàn)對RNAi轉基因植物的有效檢測,彌補現(xiàn)有轉基因檢測技術的不足。檢測體系的建立主要基于探針的制備、多重PCR、全基因組擴增、基因芯片雜交技術及PCR產(chǎn)物的變復性電泳等幾個方面。
　　 關于探針的制備,首先通過查閱大量文獻搜集并

2、整理了RNAi轉基因事件中常用轉基因元件37個,包括啟動子14個,終止子4個,選擇標記基因5個,報告基因2個和內含子12個。根據(jù)上述轉基因元件的保守序列設計引物,PCR擴增獲得點制芯片的探針。同時設置陽性、陰性和空白對照用于后期芯片雜交實驗的質量監(jiān)控。其中陽性對照為真核生物中普遍存在的18S rDNA,陰性對照為野豬肝臟中表達的一個基因,空白對照為不含任何核酸的點樣液。探針經(jīng)PCR方法擴增獲得,擴增產(chǎn)物純化定量后用于點制基因芯片。

3、>　　 本研究搜集了8種植物樣品作為檢測對象,包括4種RNAi轉基因水稻,2種普通轉基因植物,1種轉空載體的對照轉基因水稻,1種野生型水稻。提取上述樣品的基因組DNA,取一部分樣品進行多重PCR擴增,擴增產(chǎn)物與芯片雜交；另一部分樣品進行全基因組擴增,獲得足夠雜交的樣品并經(jīng)片段化處理后與芯片雜交。
　　 本研究優(yōu)化了多重PCR體系及基因組片段化體系,獲得了適用于芯片雜交的樣品。開展了樣品OsBTF3,OsCtBPA,R1和pTC

4、K303的多重PCR產(chǎn)物與芯片雜交實驗:以及OsCtBPA基因組樣品與芯片雜交實驗。兩種樣品處理方式的雜交結果顯示:多重PCR樣品與芯片雜交后檢測到強烈的轉基因元件的信號,基因組樣品與芯片雜交檢測到陽性對照、水稻基因組元件及轉基因元件的信號。芯片雜交實驗取得成功,其結果可用于下一步實驗。但結果中存在一些假陽性,因此芯片雜交實驗有待進一步完善。
　　 本研究以樣品OsCtBPA為例,根據(jù)兩次芯片雜交實驗中檢測到的啟動子和終止子設計

5、引物,擴增轉基因目的片段,根據(jù)RNAi結構的特點,利用變復性電泳實驗進行了檢測驗證。結果表明,擴增得到的RNAi轉基因目的片段,變復性后條帶位置的確發(fā)生了變化,而轉空載體的對照則沒有,說明變復性電泳實驗是可行的。本研究下一步將對其它樣品進行檢測。
　　 本研究經(jīng)過對探針制備、樣品準備、芯片點制、芯片雜交和變復性電泳等實驗體系的摸索和優(yōu)化,初步建立了依據(jù)DNA來檢測鑒定是否為RNAi轉基因植物的技術體系,可以用于對RNAi轉基因植