1、造血是人一生中不斷由多能造血干細胞更新造血祖細胞和成熟血細胞的過程。現(xiàn)在認為造血干細胞分化定向到某一個特定血細胞鏈系以及進一步分化發(fā)育為成熟細胞的過程至少部分地是由鏈系特異的轉(zhuǎn)錄因子和廣泛表達的轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用所控制。一些包含C2H2鋅指模體的轉(zhuǎn)錄因子在血細胞的分化和發(fā)育過程中扮演了重要角色。例如GATA家族、FOG和EKLF等。 我組2000年從人骨髓cDNA文庫中篩選到一個新的編碼鋅指蛋白(命名為HZF1)的cDNA(Ge

2、nBank注冊號：AF244088)。本論文在此基礎(chǔ)上研究HZF1基因結(jié)構(gòu)、表達、功能和作用機制。 對hemin誘導的K562細胞中獲得的cDNA進行PCR擴增，鑒別到HZF1基因的3種轉(zhuǎn)錄物，它們可能由HZF1初級轉(zhuǎn)錄物不同的剪接產(chǎn)生。分析發(fā)現(xiàn)HZF1基因包含四個外顯子和三個內(nèi)含子。其中一個轉(zhuǎn)錄物包含第3、4號外顯子，第二個包含第1、3、4號外顯子，第三個轉(zhuǎn)錄物包含有全部4個外顯子。這三種轉(zhuǎn)錄物的序列差異僅在5’非翻譯區(qū)，因

3、此編碼的肽鏈是一致的。HZF1編碼區(qū)長2010bp，編碼670個氨基酸殘基，其中包含連續(xù)的15個C2H2型和2個C2R2型鋅指模體。 HZF1mRNA在人的腦、心、骨骼肌、腎、肝、胰腺和胎肝中高表達；在脾、小腸和骨髓組織中等表達；在結(jié)腸、胸腺、肺和外周血白血病中少量表達。HZF1mRNA在各種造血細胞系中都有表達。在hemin誘導K562細胞向紅系分化過程中HZF1mRNA表達上調(diào)，誘導24h后HZF1mRNA表達水平到達最高

4、。同樣，在PMA誘導K562細胞向巨核系分化過程中HZF1mRNA表達上升，誘導60h后表達水平達到峰值。 把HZF1完整讀框插入到pEGFP-N1質(zhì)粒中，構(gòu)建真核表達載體pEGFP-N1-HZF1，轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，48小時后在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)HZF1融合蛋白定位在細胞核中。 為了制備HZF1特異抗體，把編碼HZF1非鋅指區(qū)的DNA順序插入到pET30a原核表達載體，構(gòu)建了pET30a-HZF1重組質(zhì)粒，

5、在大腸桿菌中誘導表達了融合蛋白HZF1-His5，并通過鎳柱對表達的融合蛋白進行了純化。以純化的蛋白作為免疫抗原，對新西蘭兔實施多次多點皮下注射免疫，獲得兔抗人HZF1免疫血清。ELISA檢測顯示血清效價在1：100000以上。證明所獲抗體能夠與HZF1特異結(jié)合。HZF1特異抗體的獲得為進一步研究HZF1功能，并為組織和細胞中HZF1的檢測奠定了一定基礎(chǔ)。 為了分析HZF1在K562細胞分化中的功能作用，構(gòu)建了一個表達HZF1

6、反義RNA的質(zhì)粒(pcDNA3.1antiHZF1)，轉(zhuǎn)染K562細胞，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。通過聯(lián)苯胺染色和RT-PCR檢測γ-globin表達的方法，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染空載體K562pcDNA3.1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞(對照)在hemin誘導下能夠正常向紅系分化。而在K562pcDNA3.1antiHZF1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中，HZF1內(nèi)源表達被阻遏，并且hemin誘導的紅系分化被抑制。通過PI染色和Giemsa染色的方法，發(fā)現(xiàn)對照K562pcDNA3.1穩(wěn)定

7、轉(zhuǎn)染細胞在PMA誘導下能夠正常向巨核系細胞分化，但是K562pcDNA3.1antiHZF1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞PMA誘導的巨核系分化明顯減弱。我們進一步以真核表達載體pAVu6為基礎(chǔ)，設(shè)計并插入能表達干擾RNA以特異抑制HZF1mRNA的短DNA順序，構(gòu)建了RNA干擾質(zhì)粒pAVu6HZF1i，轉(zhuǎn)染K562細胞，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。實驗也發(fā)現(xiàn)K562pAVu6HZF1i穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子細胞中，HZF1內(nèi)源表達被阻遏，并且顯著抑制了hemin誘導的紅系分化

8、和明顯減弱了PMA誘導的巨核細胞分化?？傊梅戳xRNA和RNA干擾實驗一致地證明了鋅指蛋白HZF1在K562細胞紅系分化和巨核系分化過程中具有重要作用。 利用雙螢光報告基因載體系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)HZF1蛋白非鋅指區(qū)具有很強的轉(zhuǎn)錄激活作用，并證明其中的一個肽段(從第49到第197氨基酸)具有幾乎和整個非鋅指區(qū)相同強度的轉(zhuǎn)錄激活作用。這些說明鋅指蛋白HZF1可能是一個轉(zhuǎn)錄活化蛋白，并且其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于第49到第197氨基酸區(qū)域。