1、血管生成素(Angiogenin，ANG)能夠促進血管新生和腫瘤增殖，然而作用機制未明。由于蛋白質(zhì)相互作用在生命活動中扮演關(guān)鍵角色，研究ANG相互作用蛋白質(zhì)將是闡明其作用機制的有效途徑。 酵母雙雜交技術(shù)是目前被普遍采用的高通量篩選相互作用蛋白質(zhì)的方法之一。在前期工作中，本實驗室已經(jīng)成功地用酵母雙雜交法從人心肌cDNA文庫篩選到22個與ANG存在相互作用的蛋白質(zhì)?？紤]到肝臟是ANG的主要合成臟器，也為了發(fā)現(xiàn)更多的ANG相互作用蛋

2、白質(zhì)，本論文再次利用酵母雙雜交方法對人肝cDNA文庫進行了篩選，并獲得了8個能夠與ANG在酵母細胞中發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)，其中有4個與從心肌cDNA文庫中篩選到的蛋白質(zhì)一致。這些與血管生成素有潛在相互作用的新蛋白的發(fā)現(xiàn)，擴充了實驗室前期發(fā)現(xiàn)的血管生成素相互作用蛋白數(shù)據(jù)庫，為探索血管生成素作用機制提供了新的線索。 磷脂混雜酶1(phospholipidscramblase1，PLSCR1)是此次篩選到的ANG相互作用蛋白之一。它

3、是一個Ⅱ型膜蛋白，最初因其磷脂混雜酶活性而得名。近年來的研究發(fā)現(xiàn)PLSCR1能夠轉(zhuǎn)位到細胞核內(nèi)，但其在細胞核內(nèi)行使的生物學功能尚不明確。 酵母雙雜交系統(tǒng)顯示的相互作用蛋白還需要利用其它研究蛋白質(zhì)相互作用的方法進一步驗證。因此，我們首先采用體外GST沉降(GST—pulldown)以及體內(nèi)免疫共沉淀(co—immunoprecipitation)技術(shù)證明了PLSCR1與ANG相互作用的真實性。為了進一步了解PLSCR1在細胞內(nèi)的

4、定位以及與ANG的共定位情況，我們用熒光蛋白CFP和YFP分別標記PLSCR1和ANG，通過轉(zhuǎn)染方法在HeLa細胞內(nèi)實現(xiàn)高表達后，用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。結(jié)果顯示，融合蛋白CFP—PLSCR1和YFP—ANG明顯地共定位于細胞核。經(jīng)FRET分析證實，兩者能夠在細胞核內(nèi)發(fā)生相互作用。此外，為排除標簽蛋白CFP和YFP對目標蛋白定位的影響，我們采用間接免疫熒光方法以及細胞核免疫共沉淀的方法檢測到不帶熒光蛋白標簽的PLSCR1與ANG也能

5、夠在細胞核內(nèi)共定位并發(fā)生相互作用。 已知細胞核內(nèi)的ANG具有促進rRNA轉(zhuǎn)錄的活性；ANG的核轉(zhuǎn)位及其促rRNA轉(zhuǎn)錄活性是ANG誘導(dǎo)細胞增殖和血管新生的基礎(chǔ)。然而到目前為止，ANG在細胞核內(nèi)促進rRNA轉(zhuǎn)錄以及調(diào)節(jié)ANG促rRNA轉(zhuǎn)錄過程的分子機制均未明了?；赑LSCR1能夠與ANG在細胞核內(nèi)發(fā)生相互作用，我們進一步檢測了PLSCR1對ANG促進的rRNA轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果顯示，在HeLa細胞內(nèi)，PLSCR1水平與rRNA

6、的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)，且過表達PLSCR1引起的rRNA轉(zhuǎn)錄活性增加必須依賴于細胞內(nèi)ANG的存在。因而，我們認為PLSCR1能夠增強ANG促進的rRNA轉(zhuǎn)錄活性。 基于以上研究結(jié)果，我們得出如下結(jié)論： 1．顆粒蛋白(granulin，GRN)、纖黏連蛋白1(fibronectin1，F(xiàn)N1)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解途徑相關(guān)的泛素連接酶HRD1(ERAD—associatedE3ubiquitin—proteinligaseHRD1

7、)、血管內(nèi)皮緊張素(vascularendothelialstatin，VE—statin)、潛在型TGF—β結(jié)合蛋白3(latenttransforminggrowthfactorbetabindingprotein3，LTBP3)、磷脂混雜酶1、Sprouty1(Spry1)和脊索蛋白(chordin，CHRD)等是用酵母雙雜交技術(shù)從人肝cDNA文庫中篩選到的8種潛在的ANG相互作用蛋白質(zhì)。 2．PLSCR1是ANG在He