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文檔簡介
1、骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種以軟骨細胞凋亡、軟骨基質(zhì)破壞、軟骨下骨骨化、骨贅形成及滑膜炎癥反應為特征的綜合性慢性疾病,好發(fā)于中老年人,給我國的醫(yī)療及經(jīng)濟帶來巨大負擔。骨關(guān)節(jié)炎的具體發(fā)病機制尚未完全闡明,目前認為軟骨基質(zhì)合成和降解的平衡失調(diào),導致軟骨基質(zhì)破壞是關(guān)節(jié)退化的主要原因。早期的治療主要包括口服非甾體類消炎藥及關(guān)節(jié)腔注射透明質(zhì)酸及激素,但這些手段只能緩解疼痛,病情易反復,并容易帶來消化系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)的副作用
2、。
芍藥苷(Paeoniflorin,PF)是從中藥白芍總苷中提取的單萜類糖苷化合物,來源于芍藥科植物芍藥根、牡丹根、紫牡丹根。由于其中藥單體成分明確,近年來國內(nèi)外大量學者對其藥理藥效作用進行了廣泛的研究,發(fā)現(xiàn)其具有擴張血管、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗炎抗?jié)?、抗自由基氧化損傷、解熱解痙等作用。在膠原誘導的關(guān)節(jié)炎模型中,PF能下調(diào)炎性因子如白介素1、6、17及腫瘤壞死因子的表達,并上調(diào)抗炎因子TGF-β的水平,從而對RA起到治療作用。在脊柱
3、退變模型的實驗中,研究者發(fā)現(xiàn)口飼一定劑量的芍藥苷能降低大鼠髓核細胞中Bax的含量,同時下調(diào)相關(guān)凋亡因子的表達,從而抑制髓核細胞的凋亡,對脊柱退行性改變起到保護作用。目前基于芍藥苷與軟骨細胞的研究探索比較少,我們想通過本研究,明確芍藥苷在骨性關(guān)節(jié)炎病理過程中,是否可以抑制軟骨細胞凋亡及軟骨基質(zhì)破壞,從而發(fā)揮關(guān)節(jié)保護作用。
本研究主要分三部分:一、首先通過體外培養(yǎng)大鼠軟骨細胞,加入不同濃度的PF干預后,用白介素-1β進行刺激,檢測
4、軟骨細胞中MMPs、TIMP-1基因及蛋白表達的差異,并進一步通過分析檢測NF-κB通路的相關(guān)蛋白表達水平來明確PF作用機制。我們的研究表明一定濃度的PF能抑制IL-1β介導的MMPs分泌,并上調(diào)TIMP-1的表達,從而拮抗IL-1β介導的軟骨降解,并且該作用通過部分抑制NF-κB通路得以實現(xiàn)。二、在體外培養(yǎng)的軟骨細胞中,觀察PF對IL-1β介導的軟骨細胞凋亡的影響。通過PF干預后,檢測軟骨細胞凋亡率、凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)基因表達。我們發(fā)現(xiàn)PF
5、能上調(diào)Bcl-2家族表達并抑制Bax表達,抑制Caspase-3活性,從而拮抗IL-1β介導的軟骨細胞凋亡。三、觀察在ACLT動物模型中,關(guān)節(jié)腔注射PF對關(guān)節(jié)軟骨的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一定濃度的PF可減輕關(guān)節(jié)軟骨損傷。我們的研究結(jié)果表明,PF很可能通過發(fā)揮抗炎及抗凋亡作用從而對關(guān)節(jié)軟骨起到保護作用。
第一部分 PF對大鼠軟骨細胞中MMPs/TIMP-1表達的影響
目的:觀察PF對IL-1β介導軟骨細胞MMPs/TIMP-1
6、表達的影響及其分子機制。
方法:取4周齡SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織,用酶消化法行體外培養(yǎng),傳代至3代穩(wěn)定后,MTT法檢測不同濃度PF對軟骨細胞活性影響,選取合適濃度范圍的PF用于后續(xù)實驗。加入不同濃度的PF預處理3小時,之后再加入IL-1β10ng/ml培養(yǎng)24小時,用實時定量PCR法檢測MMP-1,MMP-3,MMP-13及TIMP-1的基因表達,western blot檢測MMP-1,MMP-3,MMP-13,TIMP-1、核
7、轉(zhuǎn)錄因子p65亞基和轉(zhuǎn)錄抑制因子(Inhibitor of nuclear factor kappa B,IκB-α)的蛋白表達。
結(jié)果:PF能抑制IL-1β介導的MMPs基因及蛋白表達,并上調(diào)軟骨細胞中的TIMP-1水平。同時PF能抑制IL-1β介導的IκB-α降解和NF-κB磷酸化。
結(jié)論:PF可通過抑制NF-κB信號通路拮抗IL-1β介導的MMPs基因及蛋白表達,并上調(diào)TIMP-1水平。
第二部分 P
8、F對IL-1β介導的大鼠軟骨細胞凋亡的影響
目的:觀察PF對IL-1β介導的大鼠軟骨細胞凋亡的影響及其分子機制探討。
方法:體外培養(yǎng)SD大鼠軟骨細胞,待細胞活性穩(wěn)定后,用不同濃度PF預處理3小時,之后加入IL-1β10ng/ml培養(yǎng)24小時,通過乳酸脫氫酶活性檢測及流式細胞檢測明確PF對軟骨細胞凋亡的作用,Caspase-3活性試劑盒檢測Caspase-3活性,實時定量PCR法檢測Bcl-2及Bax基因表達,West
9、ern blot檢測Bcl-2,Bax,總Akt和磷酸化Akt的蛋白表達。
結(jié)果:PF能通過上調(diào)Akt磷酸化,拮抗IL-1β介導的LDH釋放及抑制軟骨細胞的凋亡,并上調(diào)Bcl-2表達,抑制Bax表達及Caspase-3活性。
結(jié)論:PF能抑制IL-1β介導的LDH釋放,透過流式細胞技術(shù)PF能拮抗IL-1β介導的軟骨細胞凋亡。進一步的分析表明PF能通過上調(diào)Bcl-2基因及蛋白表達,并下調(diào)Bax水平,同時降低Caspas
10、e-3的活性來發(fā)揮凋亡作用。該作用與Akt通路密切相關(guān)。
第三部分 PF對兔OA模型的保護作用
目的:通過建立動物模型進一步觀察驗證PF對骨關(guān)節(jié)炎的保護作用。
方法:32只新西蘭兔均分為正常組、空白組、低劑量PF組及高劑量PF組。后三組共24只行單側(cè)前交叉韌帶離斷法制作OA模型。建模4周后,分別予0.3mlDMSO、0.3ml低劑量PF(25μM)及0.3ml高劑量PF(50μM)注射,每周一次,持續(xù)5周。
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