1、肝臟是人體新陳代謝和藥物轉(zhuǎn)化的重要器官，基于肝細胞的體外培養(yǎng)細胞微系統(tǒng)或生物人工肝在醫(yī)療領(lǐng)域和藥物篩選平臺構(gòu)建方面具有重要的研究意義和實用價值。細胞體外培養(yǎng)的核心目標在于保持其近似于體內(nèi)狀態(tài)的活度與功能，在體肝細胞作為一種高度特化的極性細胞，其細胞之間的緊密連接將肝細胞頂端膜和基底側(cè)膜隔開，同時維持了肝細胞的“立方”（cuboidal）形態(tài)特征，而這種形態(tài)特征與肝細胞的功能表型維持密切相關(guān)。因此，以何種結(jié)構(gòu)基底設(shè)計實現(xiàn)肝細胞極性或形態(tài)特

2、征的維持是有關(guān)細胞平臺構(gòu)建的核心問題之一。此外，肝細胞體外培養(yǎng)微系統(tǒng)的檢驗與應(yīng)用在于細胞活力和功能表型評價，較為直接的方法是采用分子生物學技術(shù)對蛋白、基因表達或代謝產(chǎn)物的檢測分析，而相關(guān)方法通常不適于快速檢測以及對待測樣品的實時監(jiān)測，特別是在一些體積小，設(shè)計復(fù)雜的細胞微系統(tǒng)或微流控芯片中，難以獲得足夠的檢測樣本以供相應(yīng)的分子生物學技術(shù)分析。設(shè)計合理、有效的可視化細胞生長狀態(tài)分析方法將有助于彌補這些缺陷，并能夠成為細胞微系統(tǒng)在藥物篩選等領(lǐng)

3、域的參考指標。
　　本研究基于以亞細胞尺度圖式化結(jié)構(gòu)支撐HepG2細胞“立方”形態(tài)的設(shè)計思路，依據(jù)肝細胞尺寸特征構(gòu)建了微柱直徑為4、10μm，微柱間距為4、7μm，微柱高度為4μm的4種微柱陣列圖式化結(jié)構(gòu)；基于以多細胞尺度圖式化結(jié)構(gòu)實現(xiàn)HepG2細胞聚集體培養(yǎng)而維持細胞連接和極性的設(shè)計思路，依據(jù)HepG2聚集體尺寸特征構(gòu)建了內(nèi)徑100μm，深度100μm，無通道和含20μm、40μm通道的3種凹形圖式化結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，考察了圖式

4、化結(jié)構(gòu)尺寸設(shè)計對HepG2細胞生物學行為的影響。本文改進了基于TMRM（tetramethylrhodamine methyl ester）電勢熒光染料的細胞靜息膜電位（resting membrane potential，RMP）檢測方法，提高了其準確性和適用性，并以之評價了圖式化結(jié)構(gòu)中HepG2細胞RMP與生長狀態(tài)和極性的關(guān)系，提出以該方法分析體外微系統(tǒng)中細胞狀態(tài)的可行性。相關(guān)實驗結(jié)果有助于豐富細胞力學響應(yīng)、電生理響應(yīng)的相關(guān)知識，并

5、對于生物人工肝或體外細胞微系統(tǒng)的設(shè)計、構(gòu)建及評價分析具有一定的參考意義。本文的主要內(nèi)容和結(jié)果：
　　建立亞細胞尺度微柱陣列圖式化結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)上微柱面積覆蓋率（percentage of pillared area，PPA）及微柱直徑和間距尺寸影響HepG2細胞的形態(tài)發(fā)生以及粘著斑和細胞骨架裝配，HepG2細胞功能基因表達與細胞形態(tài)學特征密切相關(guān)。具體表現(xiàn)為：PPA和微柱直徑較大的結(jié)構(gòu)上易于形成“立方”細胞，其白蛋白和CYP（cyt

6、ochrome P450）表達均較高；微柱直徑較小，間距較大（PPA較小）的結(jié)構(gòu)上易于形成與平面基底相似的“扁平”狀細胞，功能基因表達較低；微柱直徑、間距均較小的結(jié)構(gòu)上易于形成“梭形”細胞，伴隨CYP基因的高表達。細胞增殖活力與微柱陣列圖式化結(jié)構(gòu)設(shè)計無顯著關(guān)系，粘著斑的數(shù)量和面積與PPA成負相關(guān)趨勢。提示合理的亞細胞尺度圖式化結(jié)構(gòu)有助于細胞形態(tài)的維持和功能表型的改善。
　　構(gòu)建多細胞尺度的凹形圖式化結(jié)構(gòu)，在上面HepG2細胞成聚集

7、體方式生長，其白蛋白和CYP基因表達較常態(tài)二維培養(yǎng)顯著提高。微小凹之間含通道的圖式化結(jié)構(gòu)較無通道組HepG2細胞功能基因表達無顯著性差異，但通道設(shè)計有助于減少細胞凋亡。凹形圖式化結(jié)構(gòu)中細胞增殖活力隨培養(yǎng)時間增長而降低，與通道設(shè)計無顯著相關(guān)性。
　　對上述兩類圖式化結(jié)構(gòu)中HepG2細胞EMT（epithelial-mesenchymal transition）行為研究發(fā)現(xiàn)，凹形圖式化結(jié)構(gòu)上或其它結(jié)構(gòu)上成聚集體狀態(tài)的細胞 E-鈣黏素集

8、中分布于細胞邊緣，平面基底或微柱陣列圖式化結(jié)構(gòu)上的鋪展細胞E-鈣黏素分布較彌散，提示后者具有不同程度的EMT傾向，進一步檢測EMT相關(guān)特征基因（α-SMA，vimentin，E-cadherin）的表達發(fā)現(xiàn)，兩類圖式化結(jié)構(gòu)和平面基底上細胞相關(guān)基因表達均無明顯差異。暗示HepG2細胞在本研究中的培養(yǎng)條件下未發(fā)生完全的EMT行為。
　　以激光共聚焦顯微鏡對細胞外溶液和細胞內(nèi)TMRM進行層掃分析，發(fā)現(xiàn)聚焦層面TMRM熒光強度會受到相鄰層

9、面的干擾，并依此改進了TMRM熒光強度取值方法；依據(jù)細胞內(nèi)外離子分布特性建立了不依賴于“零電位”的細胞內(nèi)TMRM非電勢依賴結(jié)合測算方法。以TMRM測算細胞RMP方法的改進不僅提高了檢測精度，也使之適用于三維培養(yǎng)細胞RMP的檢測。已上述方法測算了不同圖式化結(jié)構(gòu)上HepG2細胞RMP，發(fā)現(xiàn)微柱陣列圖式化結(jié)構(gòu)上細胞RMP與平面基底無顯著性差異；凹形圖式化結(jié)構(gòu)中HepG2細胞RMP顯著低于平面基底。對凹形圖示化結(jié)構(gòu)細胞RMP頻度分析發(fā)現(xiàn)，去極化