1、卵巢內(nèi)直接注射外源質(zhì)粒DNA，可以高效獲得轉(zhuǎn)基因小鼠等動(dòng)物。但有關(guān)質(zhì)粒DNA是如何進(jìn)入卵巢中的卵母細(xì)胞并整合到其染色體中的，這一過程目前尚無(wú)直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本文針對(duì)上述問題進(jìn)行了詳細(xì)研究。 在卵巢內(nèi)直接注射質(zhì)粒pIRES-EGFP 24hr后，取出實(shí)驗(yàn)組小鼠的卵巢，經(jīng)多聚甲醛固定后進(jìn)行常規(guī)石蠟切片。將EGFP基因中454 bp片段用地高辛進(jìn)行標(biāo)記，作為探針，對(duì)卵巢的石蠟切片進(jìn)行原位雜交。結(jié)果顯示，注射質(zhì)粒24 hr后，卵巢切片

2、中的原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、成熟卵泡中都可見陽(yáng)性信號(hào)，表明質(zhì)粒plRES-EGFP已經(jīng)進(jìn)入卵巢的上述各種細(xì)胞中。 實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行卵巢內(nèi)直接注射質(zhì)粒DNA后，進(jìn)行超排并收集受精卵，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4天后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)育到桑椹胚的胚胎，部分胚胎中可見較強(qiáng)的綠色熒光，發(fā)綠色熒光的胚胎的比率為68/92(74.1％)，這表明EGFP基因整合到小鼠的受精卵中且能夠表達(dá)。 隨機(jī)挑取性成熟的昆明白小鼠6只，進(jìn)

3、行卵巢內(nèi)直接注射質(zhì)粒plRES-EGFP，術(shù)后恢復(fù)48hr與同系的昆明白雄鼠交配，共獲得了F1代小鼠171只，其中PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的有111只，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率為64.91％(111/171)，PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與已知的EGFP基因的序列同源性為100％。另外，對(duì)EGFP在F1代小鼠中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，通過RT-PCR證實(shí)F1代小鼠的腎臟和肌肉中有EGFP基因的表達(dá)；隨機(jī)挑取10只轉(zhuǎn)基因F1代小鼠，分別收集其血液，經(jīng)過洗滌及固定后用流式細(xì)胞儀

4、進(jìn)行EGFP表達(dá)的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6只轉(zhuǎn)基因小鼠的血液中有EGFP的表達(dá)，其表達(dá)量在11％-80％。這說(shuō)明利用卵巢內(nèi)直接注射法注射質(zhì)粒后，外源基因較高效率地整合到卵母細(xì)胞中，經(jīng)受精后發(fā)育為轉(zhuǎn)基因小鼠。 收集F1代轉(zhuǎn)基因小鼠的卵巢、睪丸組織，甲醛固定后進(jìn)行常規(guī)石蠟切片。原位雜交后發(fā)現(xiàn)兩種組織中均有大量的陽(yáng)性信號(hào)，說(shuō)明F1代小鼠的卵巢和精巢中整合有EGFP基岡，為其遺傳到一代提供了直接證據(jù)。在此期間，將性成熟的F1代轉(zhuǎn)基岡雄鼠和雌鼠

5、合籠，目前共得到F2代小鼠121只，其中PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的有81只，陽(yáng)性率為66.94％(8l/21)，進(jìn)一步證實(shí)通過卵巢注射法獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠具有可遺傳性。 利用FISH技術(shù)對(duì)外源基因在F1代染色體中的整合位點(diǎn)進(jìn)行了定位。在35只待檢測(cè)鼠中，21只鼠的染色體分裂相雜交后能夠觀察到陽(yáng)性信號(hào)，檢出率為60％，并且發(fā)現(xiàn)整合發(fā)生在不同染色體上的不同位點(diǎn)，雜交結(jié)果中單一陽(yáng)性信號(hào)與多個(gè)陽(yáng)性信號(hào)的比率為3：18，這在染色體水平上證實(shí)了外源

6、基因的插入，并且證明其整合是隨機(jī)的。 根據(jù)小鼠基因組中的B1重復(fù)序列保守和EGFP基因的PolyA序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的基因組進(jìn)行進(jìn)一步的PCR檢測(cè)，測(cè)序結(jié)果與gene bank中小鼠基因組序列比對(duì)，結(jié)果證明，外源基因整合在小鼠的1號(hào)染色體上lA3區(qū)，190，470K-190，480K之間。 本文在組織、細(xì)胞和分子水平上證實(shí)了將外源質(zhì)粒DNA注射到性成熟小鼠的卵巢中，卵巢問質(zhì)和各級(jí)卵母細(xì)胞能夠吸收、整合