1、宏基因組學(xué)是一種對(duì)直接來(lái)自于環(huán)境樣品中的微生物群體基因組進(jìn)行研究的新的微生物研究領(lǐng)域。本論文基于宏基因組學(xué)研究方法在環(huán)境微生物研究中的眾多優(yōu)勢(shì)，擬應(yīng)用這一近年新興的研究方法對(duì)家蠶腸道中細(xì)菌種群構(gòu)成進(jìn)行調(diào)查分析，及對(duì)水環(huán)境微生物中的整合子-基因盒的分布、信息編碼情況及其在環(huán)境微生物基因組進(jìn)化中作用作一個(gè)初步的研究探討。 一、近年來(lái)快速發(fā)展的分子生物學(xué)研究證實(shí)，在多數(shù)的生態(tài)環(huán)境中可培養(yǎng)的微生物只占生態(tài)系統(tǒng)中微生物總數(shù)量的一小部分。因

2、此，通過(guò)傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法獲得的特定環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)信息顯然是很不全面的。為了更加全面地了解家蠶腸道內(nèi)微生物的群落結(jié)構(gòu)及它們的生理功能，我們采用了宏基因組學(xué)的方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法相結(jié)合來(lái)進(jìn)行研究。宏基因組的方法是：繞過(guò)培養(yǎng)障礙，用SDS-高鹽法和SDS-高鹽-凍融法直接提取家蠶腸道微生物的總DNA(即宏基因組DNA)，擴(kuò)增并建立細(xì)菌16SrDNA基因文庫(kù)，再用RFLP分析技術(shù)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選，對(duì)所獲得的序列進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3、；同時(shí)對(duì)這些細(xì)菌在家蠶腸道內(nèi)所起的作用進(jìn)行探討。 兩種四堿基限制性?xún)?nèi)切酶MspⅠ、HaeⅢ酶切分析16SrDNA基因文庫(kù)后，從205個(gè)陽(yáng)性克隆中存在發(fā)現(xiàn)有16種不同的酶切譜型。其中MspⅠ消化后有11種差異譜型，HaeⅢ消化后有5種差異譜型。從所獲得的16種酶切譜型中選擇出代表性克隆進(jìn)行測(cè)序，并將序列提交美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)進(jìn)行同源性比對(duì)。分析顯示，16條序列中有7條與6個(gè)已知的細(xì)菌屬具有同源性，分別是節(jié)桿菌屬(Ar

4、throbacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、大腸桿菌屬(Escherichia)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。另外9條序列與一些未知細(xì)菌的16SrRNA基因具有較高的同源性。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明，SWM22的來(lái)源菌可能與家蠶體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及能量的轉(zhuǎn)化有關(guān)；SWM90、SWM99、SWM8、SWM35、SWM145的來(lái)源菌可能使家蠶致病；

5、SWM94的來(lái)源菌可能能夠促進(jìn)家蠶營(yíng)養(yǎng)的轉(zhuǎn)化與吸收。SWM2、SWM19、SWM34、SWM35、SWM42、SWM62、SWM86、SWM94、SWM98、SWM141因只與一些未知細(xì)菌具有同源性，因此它們的來(lái)源菌與宿主家蠶的關(guān)系我們也不得而知。 另外，采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，我們獲得了葡萄球菌屬、芽胞桿菌屬、乳桿菌屬、節(jié)桿菌屬、埃希氏菌屬共5個(gè)屬6個(gè)種的細(xì)菌，其序列與未培養(yǎng)法獲得序列中的6條具有很高的同源性。結(jié)合非培養(yǎng)法研究所得到

6、的結(jié)果。比較分析了培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法在環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究中的優(yōu)劣。認(rèn)為，非培養(yǎng)法和培養(yǎng)法均有各自的優(yōu)點(diǎn)和不足，兩者具有較強(qiáng)的互補(bǔ)性。 二、整合子是一個(gè)能夠通過(guò)自身編碼的整合酶來(lái)獲取胞外游離基因或基因片段并使之表達(dá)的遺傳元件系統(tǒng)。整合子所捕獲的DNA單元—基因盒，是迄今為止已知的最簡(jiǎn)單的移動(dòng)元件。本研究以根據(jù)基因盒中每個(gè)基因兩側(cè)的59-堿基元件(59-baseelement，59-be)保守序列設(shè)計(jì)的引物HS286-HS287作為

7、擴(kuò)增引物，以PCR的方法從環(huán)境微生物的宏基因組DNA中擴(kuò)增基因盒，期望能夠發(fā)現(xiàn)一些新的關(guān)于整合子-基因盒系統(tǒng)的有用信息。 從采集的水樣品中提取到環(huán)境微生物宏基因組DNA，以HS286-HS287為引物擴(kuò)增到了特異性條帶，大小在300-2000bp之間。將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆，測(cè)定其插入片段的核苷酸序列。信息學(xué)分析表明，我們共得到7個(gè)不同的整合子-基因盒，含有13個(gè)可能

8、的ORF。把推導(dǎo)的氨基酸序列通過(guò)BlastP比對(duì)發(fā)現(xiàn)后，發(fā)現(xiàn)這些ORF與數(shù)據(jù)庫(kù)中的一些蛋白質(zhì)的序列有較高的同源性，其中5個(gè)序列為變形細(xì)菌的假設(shè)蛋白；一個(gè)為真菌的假設(shè)蛋白；一個(gè)為同樣來(lái)自于整合子-基因盒研究的假設(shè)蛋白序列。另外6個(gè)推導(dǎo)蛋白分別與變形細(xì)菌的功能蛋白木酮糖激酶、ComEC/Rec2類(lèi)蛋白、β-內(nèi)酰胺酶、DNA修復(fù)蛋白R(shí)ecN、Na/Pi共轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白及放線(xiàn)菌假諾卡氏屬菌的Tuf1具有較高的相似性。其中orf9-19＃、orf10

9、-20＃分別與來(lái)自于α-變形細(xì)菌苜蓿中華根瘤菌的β-內(nèi)酰胺酶、γ-變形細(xì)菌一個(gè)未培養(yǎng)的假單胞菌屬的DNA修復(fù)蛋白R(shí)ecN具有很高的相似性。我們重點(diǎn)分析了19＃和20?；蚝小?19＃的序列全長(zhǎng)1800bp,正反向各有兩個(gè)ORF。其中orf9-19＃位于19?；蚝蟹聪蛐蛄械?31-1718位，共編碼396個(gè)氨基酸。對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)orf9_19＃中含有C類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶特有的三個(gè)高度保守序列，它們分別是S94VSK、Y

10、180SN、K343TG。對(duì)A、B、C、D四類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶的氨基酸序列進(jìn)行聚類(lèi)分析后表明orf9_19＃與C類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶處于同一進(jìn)化枝上。故我們可以確定orf9_19＃為C類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶。 在20?；蚝行蛄兄?，我們預(yù)測(cè)到一個(gè)編碼DNA修復(fù)蛋白R(shí)ecN的基因orf10_20＃。根據(jù)RecN蛋白的功能特異性及前人對(duì)DNA修復(fù)系統(tǒng)的進(jìn)化研究結(jié)果使我們有理由相信在本次整合子-基因盒系統(tǒng)研究中所得到的與RecN相似的基因與微生物或其它