1、研究背景及目的:
　　動脈粥樣硬化是感染、炎癥、自身免疫等多種因素參與作用的病理過程。本課題提出如下假說:鈉尿肽C型受體基因能夠穩(wěn)定AS斑塊。為解決上述問題，我們構建了ApoE-/-小鼠頸動脈易損粥樣斑塊模型及過表達NPR-C的慢病毒，并成功將慢病毒局部轉染ApoE-/-小鼠頸動脈，同時設立生理鹽水對照組和LV-EGFP空載體組，應用病理組織學及分子生物學技術檢測相關指標，以此闡明NPR-C在ApoE-/-小鼠動脈粥樣斑塊穩(wěn)定性中

2、的作用。
　　研究方法:
　　1.ApoE-/-小鼠頸動脈易損粥樣斑塊模型構建
　　70只8周齡的雄性ApoE-/-小鼠，SPF級，遺傳學背景為C57BL/6，給予小鼠充足的水源和食物，保持室內恒溫恒濕，12h光照和12h黑暗交替。小鼠適應性高脂喂養(yǎng)2周后，給予腹腔麻醉后行右側頸總動脈套管術。沿著小鼠頸部正中切開皮膚，暴露右側頸總動脈，將內徑0.30mm，長度2.5mm頸動脈硅膠套管置于右側頸總動脈血管近分叉處外周，細

3、線固定套管，仔細縫合皮膚。于小鼠股部肌肉注射青霉素鈉預防感染，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)5周。
　　2.過表達NPR-C的慢病毒局部轉染小鼠頸動脈
　　小鼠行右側頸總動脈套管術并高脂喂養(yǎng)5周后，施行局部慢病毒轉染。將70只小鼠隨機分成3組:NS組(n=20)、LV-EGFP組(n=20)和LV-NPR-C組(n=30)。小鼠麻醉后，沿頸部正中切開皮膚，分離出右側頸總動脈，暴露血管外膜，將100uL慢病毒稀釋液(2×10^7TU)或者100

4、uLNS通過血管外膜局部浸潤到右側頸總動脈內，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)4周后行安樂死。其中，病毒轉染小鼠兩周后從LV-EGFP組隨機抽取兩只小鼠，行安樂死后用OCT包埋右側頸動脈，制作冰凍切片，并在熒光顯微鏡下觀察頸動脈斑塊內熒光情況。
　　3.體重及血生化指標檢測
　　分別在局部轉染病毒前及小鼠處死前采取血液標本，測量體重、血糖、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇水平。
　　4.血壓及心率指標檢測

5、　　分別在局部轉染病毒前及小鼠處死前使用智能無創(chuàng)血壓計測量小鼠收縮壓，舒張壓，平均動脈壓及心率。小鼠血壓每日固定時間段測量，連續(xù)測量3天，每天測量3次，取平均值。
　　5.組織病理學染色
　　小鼠行安樂死后，將右側頸動脈包埋后制作石蠟或者冰凍病理切片。頸動脈切片采用HE染色觀察各組頸動脈斑塊的大小及形態(tài);采用天狼猩紅染色觀察各組頸動脈斑塊內Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量。頸動脈冰凍切片采用油紅O染色觀察各組頸動脈斑塊內脂質的含量。

6、>　　6.免疫組織化學染色
　　小鼠頸動脈切片采用免疫組織化學染色方法檢測各組頸動脈斑塊內平滑肌抗原、NPR-C、心房鈉尿肽、CNP抗原的含量。小鼠頸動脈冰凍切片采用免疫組織化學染色方法檢測各組頸動脈斑塊內巨噬細胞抗原的含量。根據公式計算斑塊易損指數(shù):斑塊易損指數(shù)=（巨噬細胞含量百分比+脂質含量百分比）/（平滑肌細胞含量百分比+膠原含量百分比）。
　　7.RT-PCR反應
　　Trizol法提取小鼠右側頸動脈組織中RN

7、A，定量后將其逆轉為eDNA，再利用熒光定量PCR法擴增eDNA以此檢測小鼠頸動脈組織中NPR-C、基質金屬蛋白酶-9、血管細胞粘附分子-1 mRNA表達水平。以小鼠β-actin作為內參。實驗結果采用2-ΔΔCt方法統(tǒng)計分析。各項實驗指標重復3次以上。
　　8.Western blot檢測
　　提取小鼠右側頸動脈組織中總蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離各蛋白質組分后，采用濕轉法將蛋白質從凝膠轉移至硝酸纖維素膜上，隨后5％脫

8、脂牛奶封閉、TBST清洗、孵育相應一抗過夜。次日抗原和抗體復合物孵育二抗，最后利用辣根過氧化物酶標記的底物進行化學發(fā)光顯色。使用Image J圖像分析軟件以β-actin作為內參，定量檢測小鼠頸動脈組織中NPR-C、ANP、CNP、腫瘤壞死因子-α、單核細胞趨化蛋白-1的蛋白表達水平。
　　研究結果:
　　1.ApoE-/-小鼠一般情況
　　70只8周齡的雄性ApoE-/-小鼠，行右側頸總動脈套管術并給予局部孵育慢病毒

9、或NS，共計高脂飲食11周，小鼠整個實驗過程未見感染及意外死亡。
　　2.慢病毒局部成功轉染小鼠頸動脈
　　局部轉染病毒2周后，LV-EGFP組隨機選取的兩只小鼠，熒光顯微鏡下頸動脈冰凍切片見斑塊處有明顯綠色熒光表達。免疫組織化學染色顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組頸動脈斑塊內NPR-C含量明顯增加(P＜0.05); NS組和LV-EGFP組相比較，頸動脈斑塊內NPR-C含量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0

10、.05)。Western blot顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組頸動脈組織中NPR-C表達量明顯增加(P＜0.05); NS組和LV-EGFP組相比較，頸動脈組織中NPR-C表達量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。PCR結果顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組頸動脈組織中NPR-C mRNA含量明顯增加(P＜0.05); NS組和LV-EGFP組相比較，頸動脈組織中NPR-C mRNA含量無

11、統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。結果表明慢病毒局部轉染小鼠頸動脈成功。
　　3.NPR-C基因過表達組小鼠體重及血生化指標
　　比較NS組、LV-EGFP組、LV-NPR-C組三組小鼠在病毒轉染前后體重及血糖、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇水平，未見明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　4.NPR-C基因過表達組小鼠心率及血壓水平
　　比較NS組、LV-EGFP組、LV-NPR-C組三組小

12、鼠在病毒轉染前后心率、收縮壓、舒張壓、平均動脈壓的變化，未見明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　5.NPR-C基因過表達組頸動脈斑塊內脂質含量顯著減少
　　頸動脈斑塊冰凍切片油紅O染色顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組頸動脈斑塊內脂質含量明顯降低(P＜0.05); NS組和LV-EGFP組相比較，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　6.NPR-C基因過表達組頸動脈斑塊內巨噬細胞含量

13、顯著減少
　　頸動脈斑塊冰凍切片免疫組織化學染色顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組能明顯降低頸動脈斑塊內巨噬細胞含量（P＜0.05）;NS組和LV-EGFP組相比較，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　7.NPR-C基因過表達組頸動脈斑塊內平滑肌抗原含量顯著減少
　　頸動脈斑塊切片免疫組織化學染色顯示:與NS組和LV-EGFP組兩對照組相比較，LV-NPR-C實驗組頸動脈斑塊內平滑肌

14、抗原含量明顯降低（P＜0.05）;NS組和LV-EGFP組相比較，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　8.NPR-C基因過表達組頸動脈斑塊內膠原含量顯著增加
　　頸動脈斑塊切片天狼猩紅染色顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組能明顯增加頸動脈斑塊內Ⅰ、Ⅲ型膠原含量（P＜0.05）;NS組和LV-EGFP組相比較，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　9.NPR-C基因過表達組頸

15、動脈斑塊易損指數(shù)顯著降低
　　根據斑塊易損指數(shù)公式計算，與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組頸動脈斑塊易損指數(shù)明顯下降(P＜0.05);NS組和LV-EGFP組相比較，兩組頸動脈斑塊易損指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　10.NPR-C基因過表達顯著減少ANP、CNP配體表達
　　頸動脈斑塊切片免疫組織化學染色顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組能明顯降低頸動脈斑塊內AN

16、P配體(P＜0.05)和CNP配體(P＜0.05)的含量;NS組和LV-EGFP組相比較，頸動脈斑塊內ANP配體(P＞0.05)和CNP配體（P＞0.05）的含量差異無統(tǒng)計學意義。
　　Western blot顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組能明顯降低頸動脈組織中ANP配體(P＜0.05)和CNP配體(P＜0.05)表達量;NS組和LV-EGFP組相比較，頸動脈組織中ANP配體(P＞0.05)和CNP配體

17、(P＞0.05)的含量差異無統(tǒng)計學意義。
　　11.NPR-C基因過表達顯著減少炎癥因子TNF-α、MCP-1、MMP-9、VCAM-1的表達
　　Western Blot顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組能明顯降低頸動脈組織中TNF-α(P＜0.05)、MCP-1(P＜0.05)的蛋白含量;NS組和LV-EGFP組相比較，頸動脈組織中TNF-α(P＞0.05)、MCP-1(P＞0.05)的蛋白含量差

18、異無統(tǒng)計學意義。
　　PCR結果顯示:與NS組和LV-EGFP組相比較，LV-NPR-C組頸動脈組織中MMP-9 mRNA和VCAM-1 mRNA表達明顯降低(P＜0.05);NS組和LV-EGFP組相比較，頸動脈組織中MMP-9 mRNA和VCAM-1 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結論:
　　構建小鼠頸動脈易損粥樣斑塊模型，局部轉染過表達NPR-C的慢病毒，證實了NPR-C能夠改善斑塊的組