1、獼猴桃潰瘍病對于獼猴桃產業(yè)來說是一種具有毀滅性的細菌性病害。目前，獼猴桃潰瘍病在中國、意大利、新西蘭等國家嚴重發(fā)生，嚴重制約著獼猴桃產業(yè)的發(fā)展。丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonas syringae pv. actinidiae)是獼猴桃潰瘍病的病原菌。其中 phaseolotoxin毒素是獼猴桃潰瘍病發(fā)生的一個關鍵因素。然而，該毒素對獼猴桃潰瘍病菌致病機制的影響尚未明確。因此我們通過轉座子誘變的方法得到 phaseolo

2、toxin毒素合成喪失突變株，克隆得到 phaseolotoxin毒素相關基因，明確了獼猴桃潰瘍病菌基因中phaseolotoxin毒素相關基因的功能，為揭示phaseolotoxin毒素致病機制的研究奠定基礎。研究內容如下：
　　1.獼猴桃潰瘍病菌 Tn5突變體庫的構建以獼猴桃潰瘍病菌產phaseolotoxin毒素菌株 AHP18為材料，利用 EZ-Tn5 Tnp Transposome轉座系統

3、，在電壓1200 V/cm的條件下電擊5 ms，將含有卡那抗性基因的EZ-Tn5轉座子插入到AHP18的基因組中，構建獼猴桃潰瘍病菌的Tn5插入突變體庫，共獲得254株突變株。通過在含卡那霉素50μg/mL的LB平板上連續(xù)繼代培養(yǎng)7代，初步確定Tn5穩(wěn)定插入到獼猴桃潰瘍病菌的基因組中。
　　2. Phaseolotoxin毒素合成喪失突變株的篩選根據篩選獲得的最佳產毒體系，及利用在M9培養(yǎng)基中，初始濃度 OD600為0.1，18℃

4、培養(yǎng)48 h，獲得EZ-Tn5突變株和AHP18野生型菌株的粗提取物。利用室內平板 Escherichia coli生長抑制試驗方法初篩得到毒素合成喪失突變株19株。為了進一步確定毒素合成喪失突變株，我們利用冷凍干燥濃縮手段將獲得的突變株產生的粗提取物進行濃縮，運用 E. coli生長抑制試驗和TLC吸附層析方法進行復篩，最終篩選得到6株phaseolotoxin毒素合成喪失和減弱的突變株。
　　3.獼猴桃潰瘍病菌phaseolo

5、toxin毒素喪失突變株的鑒定根據已報導的引物PsaF1/PsaR2，PsaF3/PsaR4對獲得的突變株進行雙重PCR檢測，結果表明在175 bp和280 bp位置處出現兩條目的條帶，確定突變株是由野生型菌株突變而來；根據 EZ-Tn5轉座子的特有序列，設計轉座子特異性引物對 EZ-Tn5F（ AGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAG）/ EZ-Tn5R（ AACATCATTGGCAAC GCTACCT），對獲得的突變株進行轉

6、座子特異性PCR，通過PCR獲得1060 bp的目的片段，從而驗證了EZ-Tn5穩(wěn)定插入到毒素合成喪失突變體的基因組中。
　　4. Tn5插入失活基因的克隆及其序列分析根據轉座子EZ-Tn5兩端的序列，設計3對嵌套引物，同時依據物種蛋白質普遍存在的保守氨基酸序列設計簡并引物，采用TAIL-PCR方法擴增轉座子插入位點的側翼序列。以毒素合成喪失突變株AHP1846，AHP1879的基因組DNA為模板，用簡并引物和嵌套引物組成的引物組

7、合進行TAIL-PCR擴增。結果表明利用左端引物LSP1，LSP2，LSP3從突變株AHP1846基因組中克隆得到293 bp的序列。對獲得的側翼序列利用DNAStar、DNAMAN以及NCBI網站上的BLAST等生物信息學軟件進行分析。結果與P. syringae pv. actinidiae公布的glmS基因同源性為100％，該基因編碼6-磷酸果糖谷氨酰胺氨基轉移酶（L-glutamine:D-fructose-6-phosphat

8、e aminotransferase，簡稱GFAT）。
　　根據已公布的獼猴桃潰瘍病菌和其他革蘭氏陰性細菌的glmS基因的保守區(qū)設計引物對GF/GR，以獼猴桃潰瘍病菌野生型菌株AHP18的基因組為模板，獲得了1836 bp的片段。結果發(fā)現與P. syringae pv. actinidiae公布的glmS基因同源性為100%，確定側翼序列位于glmS基因的916-1133的位置處。
　　為了驗證EZ-Tn5轉座子在毒素喪失突

9、變株AHP1846的基因組中插入的拷貝數，我們根據轉座子序列設計探針引物TZF/TZR，DNA探針利用地高辛標記，將AHP1846的基因組DNA經過HindⅢ限制性內切酶消化后通過Southern雜交法來分析。Southern雜交結果得到一條單一的條帶，表明轉座子EZ-Tn5在AHP1846的基因組中為單拷貝插入。
　　5.轉座子插入失活基因對獼猴桃潰瘍病菌致病性的影響利用針刺注射法將突變株AHP1846和AHP1879和野生型菌

10、株AHP18接種煙草，結果表明插入失活基因菌株AHP1846以及突變株AHP1879均未誘導煙草產生過敏性反應，而野生型菌株 AHP18對煙草誘導出明顯的過敏癥狀。通過摩擦接種法接種獼猴桃離體和活體的葉片，結果表明插入失活基因菌株AHP1846以及突變株AHP1879對獼猴桃葉片喪失致病力，而接種野生型菌株 AHP18的葉片出現典型的褐色斑。通過創(chuàng)傷接種法接種獼猴桃離體和活體的嫩枝，結果2個突變株均喪失致病力，而接種野生型菌株的嫩枝在接