1、背景:
　　隨著全球患者數(shù)量快速的增多和患病率迅速的增長，糖尿病已經(jīng)成為本世紀(jì)全球所面臨的最嚴(yán)重、最危急的公共健康問題之一。2型糖尿病(type2 diabetes mellitus，T2DM)是最常見的也是最主要的糖尿病類型，而其中67.1％患者伴有血脂異常。
　　目前，小鼠糖尿病模型的建立最常采用的是化學(xué)法，其中通過腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)應(yīng)用十分廣泛。有研究顯示通過小劑量多次腹腔注射STZ

2、能夠成功構(gòu)建T2DM模型。反之，構(gòu)建1型糖尿病模型則通常采用大劑量STZ注射。而在本實驗中，我們嘗試?yán)酶咧嬍陈?lián)合大劑量STZ方式構(gòu)建T2DM伴高脂血癥小鼠模型并對其進行評價。
　　G蛋白偶聯(lián)受體被發(fā)現(xiàn)與糖尿病以及心血管疾病有著密切的聯(lián)系。β3腎上腺素能受體(β3-AR)作為膜受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族。目前β3-AR在心肌中的作用存在分歧。一部分研究發(fā)現(xiàn)β3-AR在心衰大鼠心臟的心房及心室中的表達均明顯上調(diào)，認為其對壓力超

3、負荷的肥大心肌以及心衰心肌能起到保護作用。而另一部分研究發(fā)現(xiàn)β3-AR持續(xù)增長，產(chǎn)生過度的負性肌力作用，從而導(dǎo)致心功能的進行性惡化。其中值得注意的是，研究發(fā)現(xiàn)對心肌細胞使用β3-AR激動劑，能夠明顯增加心肌細胞凋亡，因此我們推測β3-AR可能通過增加細胞凋亡從而導(dǎo)致心臟功能的損傷。
　　線粒體動態(tài)平衡的紊亂與心血管疾病密切相關(guān)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成的增加在其中起著不可忽視的作用。RO

4、S被認為與糖尿病心肌損傷有著密切的關(guān)系。當(dāng)ROS的產(chǎn)生超過了機體的抗氧化能力后，就會對細胞的細胞膜、DNA和蛋白直接損傷，導(dǎo)致細胞凋亡。此外，線粒體動態(tài)平衡的紊亂將導(dǎo)致線粒體功能障礙。而線粒體內(nèi)膜的融合主要由視神經(jīng)萎縮癥蛋白1(optical atrophy-1，OPA1)來介導(dǎo)。有研究顯示糖尿病小鼠心臟線粒體中OPA1的表達量明顯降低，并且線粒體出現(xiàn)了顯著的分裂和形態(tài)異常。
　　因此，本研究通過建立T2DM伴高脂血癥小鼠模型和高

5、糖高脂細胞模型，探討β-AR/OPA1在高糖高脂對心肌細胞損傷中的作用機制。
　　方法:
　　1.將SPF級C57BL/6J遺傳背景健康雄性小鼠分為兩組:對照組進食普通飼料;實驗組進食60％脂肪熱能的高脂飼料(D12492)3周后予以腹腔注射STZ（100mg/kg）。兩組小鼠測量體重、空腹血糖、進行葡萄糖耐量試驗。檢測小鼠血清TG水平、TC水平、LDL-c水平、FFA水平，ELISA試劑盒檢測血清胰島素含量。檢測血清BNP

6、以及心臟超聲檢查。肝臟組織油紅O染色。通過實時熒光定量PCR和Western blot檢測OPA1的表達。
　　2.實驗組小鼠再次隨機分為三組:生理鹽水組（腹腔注射生理鹽水）、激動劑組（腹腔注射BRL37344）、抑制劑組（腹腔注射SR52390A）。實時熒光定量PCR和Westernblot檢測心肌組織β3-AR和OPA1表達情況。Masson染色觀察心肌纖維化情況。電鏡觀察心肌線粒體結(jié)構(gòu)變化。免疫熒光染色觀察OPA1表達情況。

7、
　　3.小鼠心肌細胞系(MCM)分為3組:高糖+0μmol/L軟脂酸鈉干預(yù)組、高糖+200μmol/L軟脂酸鈉干預(yù)組、高糖+400μmol/L軟脂酸鈉干預(yù)組，并分別干預(yù)8小時和16小時。通過流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡變化。實時熒光定量PCR和Western blot檢測OPA1的表達。siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建OPA1下調(diào)的心肌細胞模型并通過實時熒光定量PCR和Western blot檢測siRNA轉(zhuǎn)染的有效性。測定各組細胞ROS變化

8、情況、凋亡情況、線粒體膜電位和ATP變化情況。觀察NAC干預(yù)后ROS變化和凋亡變化。
　　結(jié)果:
　　1.予以進食含60％脂肪熱能的高脂飼料(D12492)后小鼠體重明顯升高，肝臟組織油紅O染色可見明顯的脂肪滴。腹腔注射STZ后空腹血糖、血清胰島素含量明顯升高、糖耐量異常，檢測血清TG水平、TC水平、LDL-c水平、FFA水平均較普通進食小鼠明顯升高。T2DM伴高脂血癥小鼠血清BNP升高，心臟超聲檢查結(jié)果提示舒張功能受損，心

9、肌OPA1在mRNA和蛋白水平上表達減少。
　　2.β3-AR激動劑上調(diào)β3-AR并抑制OPA1的表達，加重線粒體結(jié)構(gòu)破壞;β3-AR抑制劑在下調(diào)β3-AR的同時能夠上調(diào)OPA1表達。免疫熒光染色與實時熒光定量結(jié)果與前保持一致。Masson染色發(fā)現(xiàn)，β3-AR激動劑加重心肌組織纖維化，抑制劑減輕纖維化。
　　3.通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，隨著軟脂酸鈉濃度增加和干預(yù)時間的延長，心肌細胞凋亡水平明顯增加。高脂干預(yù)后小鼠心肌細胞OP

10、A1在mRNA和蛋白水平上的表達減少，但ROS水平卻顯著升高。OPA1 siRNA轉(zhuǎn)染成功后發(fā)現(xiàn)心肌細胞ROS水平升高、凋亡增加、線粒體膜電位降低和ATP減少。予以NAC干預(yù)后ROS水平下降，凋亡減少。
　　結(jié)論:
　　本實驗通過高脂飲食聯(lián)合大劑量STZ建立T2DM伴高脂血癥小鼠模型。高糖高脂狀態(tài)下OPA1能夠通過抑制氧化應(yīng)激減輕心肌凋亡。T2DM伴高脂血癥小鼠心肌組織中β3-AR表達增加。通過激動β3-AR能夠下調(diào)OPA1