1、2型糖尿病是冠心病的等危癥，血管并發(fā)癥的發(fā)生是糖尿病患者出現(xiàn)高致殘率、高致死率的主要原因。冠心病與血瘀證關系密切，糖尿病高血糖狀態(tài)下存在的高血粘度現(xiàn)象以及伴隨局部血栓形成的血管并發(fā)癥是中醫(yī)“血瘀”的具體體現(xiàn)。以陳可冀院士為首的課題組一直致力于血瘀證實質(zhì)的探索，前期通過納入冠心病血瘀證患者并應用寡核苷酸基因芯片技術成功構建了冠心病血瘀證白細胞差異基因表達譜，同時進一步深入分析發(fā)現(xiàn)，其中的差異基因蛋白激酶Cβ1(PKCβ1)位于冠心病血瘀證

2、疾病網(wǎng)絡的關鍵調(diào)控環(huán)節(jié)。機體血糖水平過高是導致糖尿病血管病變發(fā)生的主要病理因素。高血糖狀態(tài)下，血糖的急劇波動更容易誘發(fā)血管內(nèi)皮損傷和血管并發(fā)癥的發(fā)生。這已成為現(xiàn)階段糖尿病預防和治療研究領域的熱點之一。蛋白激酶C(PKC)途徑被認為是糖尿病血管病變的關鍵機制。那么，作為冠心病血瘀證關鍵調(diào)控基因的PKCβ1是否也在具有明顯血瘀證證候特點的糖尿病血管并發(fā)癥，特別是波動性高血糖誘導的血管內(nèi)皮損傷中發(fā)揮重要作用呢？機體“血瘀證”狀態(tài)往往伴隨著體內(nèi)

3、血小板的高聚集活化，那么，在具有明顯血瘀征象的糖尿病患者體內(nèi)，血糖波動性的增加是否會對其機體的血小板聚集活化產(chǎn)生影響？作為冠心病血瘀證關鍵調(diào)控分子的PKCβ1又與其具有怎樣的關系呢？赤芍、川芎作為具有代表性的活血化瘀中藥，廣泛用于血瘀證的臨床治療并取得良好療效。芍藥苷、川芎嗪分別是赤芍、川芎的有效部位，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其均具有較好的保護血管內(nèi)皮、抑制血小板聚集活化、抗動脈粥樣硬化以及防治冠心病介入術后支架再狹窄等作用。那么，其保護血管內(nèi)

4、皮功能、抗血小板聚集活化的作用是否與調(diào)控PKCβ1基因有關？其在波動性高血糖繼發(fā)血管病變效應中是否也發(fā)揮重要作用呢？
　　本研究通過納入2型糖尿病患者，觀察血糖波動幅度與2型糖尿病患者血小板活化、血管內(nèi)皮損傷及PKCβ1表達的相關性;體外構建波動性高血糖誘導損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞實驗模型和人血小板—臍靜脈內(nèi)皮細胞實驗體系，觀察赤芍川芎有效部位對波動性高血糖損傷血管內(nèi)皮的保護效應以及PKCβ1表達變化的情況，探討波動性高血糖誘導人臍靜

5、脈內(nèi)皮細胞損傷培養(yǎng)液溫育對人外周血血小板聚集的影響以及PKCβ1在其中所扮演的角色;體內(nèi)動物實驗通過引入“升糖指數(shù)”(Glucose Index，GI)的概念，構建2型糖尿病大鼠波動性高血糖和穩(wěn)定性高血糖模型，觀察赤芍川芎有效部位對血糖波動狀態(tài)下2型糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能、血小板聚集活化以及冠心病血瘀證關鍵調(diào)控分子PKCβ1表達的影響，探討赤芍川芎有效部位拮抗波動性高血糖介導內(nèi)皮損傷和血小板過度活化的相關機制，為活血化瘀中藥防治糖尿病血

6、管并發(fā)癥的臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　本課題研究包括以下兩部分:文獻綜述和實驗研究。
　　1.文獻綜述:本部分從“糖尿病血管病變、血瘀證與活血化瘀”、“波動性高血糖、血管內(nèi)皮損傷與血小板過度活化”和“PKCβ與糖尿病血管病變研究進展”三個方面進行綜述。
　　2.實驗研究:包括以下五個部分。
　　研究一：2型糖尿病患者血糖波動狀態(tài)與血管內(nèi)皮損傷、血小板活化及PKCβ1表達的相關性研究
　　目的:明確血糖波動狀

7、態(tài)與血管內(nèi)皮損傷、血小板活化及PKCβ1表達的相關性。
　　方法:2型糖尿病診斷標準按照2010年中華醫(yī)學會糖尿病學分會的《中國2型糖尿病防治指南》進行。篩選符合入選標準的2型糖尿病患者38例作為研究對象。在未進行藥物干預措施調(diào)整之前，進行七點法指端毛細血管血糖測定[三餐前（早餐前（空腹）、午餐前、晚餐前，三餐后2h及睡前9點]來計算平均血糖波動幅度(MAGE);采血測定外周血血小板最大聚集率和血小板膜蛋白CD62p表達;采用離子

8、交換高壓液相法檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)水平;采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清E-選擇素(E-selectin)、血管性血友病因子(vWF)和蛋白激酶Cβ1(PKCβ1)水平;同時，進行其他一般性指標檢測。以HbA1c作為評價長期血糖控制的監(jiān)測指標，MAGE作為評價血糖波動性的指標，并觀察血清E-selectin水平、血清vWF水平、血小板最大聚集率和血小板膜蛋白CD62p表達分別與血清PKCβ1水平和MAGE以及血清PKC

9、β1水平與MAGE和HbA1c水平之間的相關性。
　　結果:入組患者的年齡、體重、病程、病史等一般資料與血清E-selectin、血清vWF、血清PKCβ1、血小板最大聚集率、血小板膜蛋白CD62p表達和MAGE之間均無顯著相關性;內(nèi)皮損傷標志物血清E-selectin和血清vWF水平、血小板最大聚集率和血小板膜蛋白CD62p表達與MAGE之間均存在顯著相關性(P＜0.01);冠心病血瘀證目標分子PKCβ1與血糖評價指標（MAGE

10、和HbA1c）、內(nèi)皮損傷標志物（E-selectin和vWF）、血小板最大聚集率和CD62p表達水平之間均存在顯著相關性（P＜0.05或P＜0.01），均可以建立回歸方程。
　　結論:冠心病血瘀證關鍵調(diào)控分子PKCβ1與糖尿病患者血糖波動狀態(tài)下的血管內(nèi)皮損傷程度和血小板活化聚集水平密切相關。
　　研究二：波動性高血糖誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)損傷過程中PKCβ1表達及赤芍川芎有效部位的干預效應研究
　　目的:

11、觀察波動性高血糖對人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷過程中PKCβ1表達的影響及赤芍川芎有效部位的干預效應。
　　方法:以體外培養(yǎng)HUVECs作為研究對象，實驗共分為以下9組:正常低糖組（N組）:以低糖型DMEM(5.56mmol/L)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每24 h更換一次培養(yǎng)基;穩(wěn)定性高糖組（W組）:以高糖型（25mmol/L）DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每24h更換一次培養(yǎng)基;波動性高糖組（B組）:以低糖型DMEM全培養(yǎng)基/高糖型DMEM全培養(yǎng)基培

12、養(yǎng)，每24h交替更換一次;穩(wěn)定性高糖+LY333531組（WL組）:采用PKCβ1阻斷劑LY333531預處理1h后，以高糖型DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每24h更換一次培養(yǎng)基;波動性高糖+LY333531組（BL組）:采用PKCβ1阻斷劑LY333531預處理1h后，以低糖型DMEM全培養(yǎng)基/高糖型DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24h交替更換一次;波動性高糖+川芎嗪組（TMP組）:以低糖型DMEM全培養(yǎng)基/高糖型DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24h交

13、替更換一次，并應用鹽酸川芎嗪(TMP，500μM)進行干預;波動性高糖+芍藥苷組（PAE組）:以低糖型DMEM全培養(yǎng)基/高糖型DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24h交替更換一次，并應用芍藥苷（PAE，100μM）進行干預;波動性高糖+鹽酸二甲雙胍組(MH組):以低糖型DMEM全培養(yǎng)基/高糖型DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24h交替更換一次，并應用鹽酸二甲雙胍（MH，1mM）進行干預;波動性高糖+阿司匹林組（ASA組）:以低糖型DMEM全培養(yǎng)基/高糖型

14、DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24h交替更換一次，并應用阿司匹林(ASA，1mM)進行干預。細胞培養(yǎng)8d，采用倒置相差顯微鏡進行細胞形態(tài)學觀察，采用流式細胞術檢測細胞活性和凋亡。收集細胞培養(yǎng)上清液，應用ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α[(TNF-α)、血小板內(nèi)皮細胞粘附分子-1(PECAM-1)、活性氧(ROS)含量和總抗氧化能力(T-AOC);應用Western blot法檢測細胞PKCβ1蛋白表達。
　　結果:
　　1.細胞形

15、態(tài)學觀察:與N組相比，W組和B組細胞明顯腫脹、凋亡和壞死，且B組較W組更顯著。應用LY333531抑制PKCβ1表達后細胞狀態(tài)明顯好轉。應用TMP、PAE、MH和ASA干預后，細胞狀態(tài)較B組均有不同程度改善。
　　2.細胞活性和凋亡水平檢測:與N組相比，B組和W組細胞活性顯著下降、細胞總凋亡率（以晚期凋亡為主）明顯升高(P＜0.01)，且B組較W組更顯著(P＜0.05或P＜0.01)。應用LY333531阻斷后，WL組和BL組細胞

16、總凋亡率均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）;TMP、PAE、MH和ASA干預亦可顯著降低細胞的總凋亡率(P＜0.01)，其中PAE對早期凋亡(P＜0.01)和晚期凋亡(P＜0.01)均具有顯著抑制效應。
　　3.炎癥反應和氧化應激相關指標檢測:與N組相比，W組和B組細胞TNF-α、PECAM-1、ROS含量均顯著增多(P＜0.01)，T-AOC顯著下降(P＜0.01);與W組比較，B組細胞TNF-α、PECAM-1含量又有進

17、一步升高(P＜0.01，P＜0.05)，T-AOC進一步降低(P＜0.01);應用LY333531阻斷后，WL組和BL組細胞TNF-α、PECAM-1、ROS水平出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），同時伴T-AOC顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）;TMP、PAE、MH和ASP干預與LY333531效應相似。
　　4.細胞PKCβ1蛋白水平檢測:與N組相比，W組和B組細胞PKCβ1蛋白表達均顯著升高（P＜0.05或P＜

18、0.01），B組較W組又出現(xiàn)明顯升高(P＜0.05);應用LY333531阻斷后，WL組和BL組細胞PKCβ1蛋白表達水平明顯降低(P＜0.01);TMP、PAE、MH和ASA干預與LY333531具有相似效應。
　　結論:波動性高血糖能夠顯著誘導并加重人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷和凋亡，且該效應與PKCβ1過表達密切相關;赤芍川芎有效部位對波動性高血糖狀態(tài)下的血管內(nèi)皮功能損傷具有明顯的保護作用，該作用機制與其顯著抑制PKCβ1表達進而減

19、輕氧化應激和炎癥反應密切相關。
　　研究三：波動性高血糖對人血小板聚集活化的影響及赤芍川芎有效部位和PKCβ1抑制的干預效應研究
　　目的:觀察波動性高血糖對人血小板聚集活化的影響及赤芍川芎有效部位和PKCβ1抑制的干預效應。
　　方法:首先，予人臍靜脈內(nèi)皮細胞以不同條件葡萄糖進行培養(yǎng):正常低糖組(N組):以低糖型DMEM(5.56mmol/L)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每24 h更換一次培養(yǎng)基;穩(wěn)定性高糖組（W組）:以高糖型(

20、25mmol/L) DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每24h更換一次培養(yǎng)基;波動性高糖組（B組）:以低糖型DMEM全培養(yǎng)基/高糖型DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每24h交替更換一次。連續(xù)培養(yǎng)8d后，收集細胞上清液，置于-80℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。其次，選取健康志愿者15例，于清晨進食前使用BD枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)真空采血管采集10mL空腹全血，以1000r/min離心10min收集富血小板血漿（PRP），3000r/min離心10min，提取貧血小板血漿

21、(PPP)。最后，將第一步收集到的不同培養(yǎng)條件培養(yǎng)的細胞上清液作為誘導劑加入收集到的PRP中進行血小板最大聚集率的檢測。同時，應用PKCβ1阻斷劑LY333531以及TMP、PAE、MH和ASA對不同組血小板進行預處理15min。實驗共計分為以下9組:正常低糖組（N組）、穩(wěn)定性高糖組（W組）、穩(wěn)定性高糖+LY333531組（WL組）、波動性高糖組（B組）、波動性高糖+LY333531組（BL組）、波動性高糖+川芎嗪組（TMP組）、波動性

22、高糖+芍藥苷組（PAE組）、波動性高糖+二甲雙胍組（MH組）和波動性高糖+阿司匹林組（ASA組）。
　　結果:與N組相比，W組和B組健康人外周血血小板最大聚集率均明顯增高(P＜0.01)，且B組較W組又有顯著升高(P＜0.01);而應用PKCβ1阻斷劑LY333531以及TMP、PAE、MH和ASA藥物預處理15min后，波動高糖誘導的血小板最大聚集率均顯著下降(P＜0.01)。
　　結論:波動性高血糖誘導人臍靜脈內(nèi)皮損傷培

23、養(yǎng)液溫育具有顯著促進健康人血小板聚集的作用，PKCβ1抑制劑及赤芍川芎有效部位對此均具有顯著的拮抗效應，赤芍川芎有效部位的抗血小板聚集效應可能與其抑制PKCβ1表達相關。
　　研究四：2型糖尿病大鼠血糖波動模型的建立
　　目的:建立2型糖尿病大鼠血糖波動模型。
　　方法:SD大鼠30只，普通飼料適應性喂養(yǎng)1w后，開始高糖高脂喂養(yǎng)，喂食方式采用定時定點投食，每日8:00-9:00、14:00-15:00和20:00-21

24、:00共計三次，每次持續(xù)1h。4w后，按30 mg/kg劑量一次性予以腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，使用檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液進行配制，pH4.4)，STZ注射3d后連續(xù)測定造模大鼠空腹和餐后血糖，以空腹血糖大于11.1mmol/L且餐后血糖不大于33.3mmol/L作為入組標準，成功納入符合要求的2型糖尿病(T2DM)大鼠16只。根據(jù)血糖和體重水平將成功納入的T2DM大鼠分為兩組:高GI飲食組和低GI飲食組。仍采用定時投食的方法，正常

25、組喂以基礎飼料，高GI組喂以高GI飼料，低GI組喂以低GI飼料。同時，采用尾靜脈采血法測定各組大鼠三餐前和餐后2h血糖，連續(xù)測定5d。實驗完成后，腹主動脈采血，分離血清用于空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TC)、胰高血糖素(glucagon)和胰島素(insulin)水平的檢測并計算胰島素敏感指數(shù)(Insulin Sensitive Index，ISI)。
　　結果:
　　1.體重及血清生化指標:與正常組相比

26、，高GI飲食組和低GI飲食組糖尿病大鼠體重以及血清FBG、TC和TG水平均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），且兩組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.血清glucagon、insulin和ISI水平:與正常組相比，高GI飲食組（波動組）和低GI飲食組（穩(wěn)定組）大鼠血清glucagon和insulin水平均顯著升高，ISI顯著降低(P＜0.01)，且兩組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　3.血糖波動情況:與

27、正常組相比，高GI飲食組和低GI飲食組糖尿病大鼠MAGE和最大血糖波動幅度(LAGE)均出現(xiàn)較大幅度升高(P＜0.01);與低GI飲食組比較，高GI飲食組MAGE和LAGE的增高幅度更為明顯(P＜0.05，P＜0.01)。
　　結論:在不影響大鼠整體血糖水平的情況下，高GI飲食組糖尿病大鼠比低GI飲食組大鼠具有更加明顯的血糖波動。運用高GI飲食和低GI飲食喂養(yǎng)2型糖尿病大鼠可以成功構建2型糖尿病大鼠血糖波動模型，且該模型可保證2型

28、糖尿病大鼠血糖相對穩(wěn)定。
　　研究五：赤芍川芎有效部位對波動性高血糖大鼠血管內(nèi)皮損傷過程中血小板活化及PKCβ1表達的影響
　　目的:觀察波動性高血糖大鼠血管內(nèi)皮損傷過程中血小板活化及PKCβ1表達情況及赤芍川芎有效部位的干預效應。
　　方法:SD大鼠100只，普通飼料適應性喂養(yǎng)2w后，隨機選取10只作為正常對照組（N組）。余下90只大鼠進行高糖高脂飼料喂食，喂食方式采用定時定點投食(每日8:00-9:00、14:00

29、-15:00、20:00-21:00共計三次，每次持續(xù)1h)。4w后按30mg/kg劑量一次性經(jīng)腹腔注射STZ，3d后連續(xù)測定模型大鼠空腹和餐后2h血糖，以空腹血糖大于11.1mmol/L且餐后血糖不大于33.3mmol/L作為入選標準，成功納入符合要求的2型糖尿病大鼠62只。根據(jù)大鼠平均血糖和體重將成功納入的2型糖尿病大鼠分為以下6組:穩(wěn)定高糖組（W組，11只）:每日定時喂食低GI飼料;波動高糖組（B組，11只）:每日定時喂食高GI飼

30、料;波動高糖+二甲雙胍組（MH組，10只）:每日定時喂食高GI飼料，并按150mg/kg/d灌服鹽酸二甲雙胍混懸液;波動高糖+阿司匹林組(ASA組，10只):每日定時喂食高GI飼料，并按60mg/kg/d灌服阿司匹林腸溶片混懸液;波動高糖+川芎嗪組（TMP組，10只）:每日定時喂食高GI飼料，并按100mg/kg/d灌服鹽酸川芎嗪混懸液;波動高糖+芍藥苷組（PAE組，10只）:每日定時喂食高GI飼料，并按10mg/kg/d灌服芍藥苷混懸

31、液。正常組（N組，10只）:每日定時喂食基礎飼料，并灌服等體積蒸餾水。藥物干預6w后，所有大鼠禁食12h，腹主動脈采血，部分血液分離血清后用于進行生化檢測，部分置于抗凝管中用于血小板蛋白提取和流式細胞術檢測。分離大鼠腹主動脈和胸主動脈，取上端2cm，將其固定于20％甲醛中進行切片及蘇木素-伊紅(H&E)染色用于組織形態(tài)學觀察，其余部分液氮迅速凍存后置于-80℃冰箱保存，用于主動脈PKCβ1蛋白表達檢測。
　　結果:
　　1.

32、主動脈病理結果:與N組相比，W組和B組主動脈組織出現(xiàn)了明顯的紊亂、損傷以及早期動脈粥樣硬化斑塊征象，且B組損傷程度更為嚴重;與B組相比，TMP組、PAE組、MH組和ASA組大鼠主動脈內(nèi)皮組織結構及狀態(tài)均有不同程度改善。
　　2.體重和血清生化指標:與N組相比，W組和B組糖尿病大鼠血清FBG、TC、TG水平均出現(xiàn)明顯增高(P＜0.01)，大鼠體重與insulin水平出現(xiàn)顯著降低(P＜0.01);但W組與B組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞

33、0.05)。與B組相比，TMP組、PAE組和MH組大鼠血清FBG、TC、TG水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），同時insulin顯著增加(P＜0.01)，ASA組則無顯著變化。
　　3.炎癥反應和氧化應激相關指標:與N組相比，W組和B組糖尿病大鼠血清vWF、E-selectin和ROS含量均顯著增多(P＜0.01)，SOD和T-AOC水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），且B組與W組之間具有顯著差異(P＜0.05

34、或P＜0.01)。與B組相比，TMP組、PAE組、MH組和ASA組大鼠血清vWF、E-selectin、ROS含量不同程度下降（P＜0.05或P＜0.01），同時伴有SOD和T-AOC水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。
　　4.血小板膜蛋白CD62p水平:與N組相比，W組和B組大鼠血小板膜糖蛋白CD62p水平均顯著增加(P＜0.01)，且B組與W組之間具有顯著差異(P＜0.05)。與B組相比，TMP組、PAE組、MH組和

35、ASA組大鼠血小板膜蛋白CD62p表達均有不同程度降低（P＜0.05或P＜0.01）。
　　5.血清、血小板及主動脈PKCβ1蛋白表達:與N組相比，W組和B組大鼠血清PKCβ1、主動脈及血小板PKCβ1蛋白表達均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），且B組與W組之間具有顯著差異(P＜0.05或P＜0.01)。與B組相比，TMP組、PAE組和MH組大鼠血清、主動脈和血小板PKCβ1蛋白表達均明顯下降(P＜0.05或P＜0.01);