1、中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文綠色木霉α1，2甘露糖苷酶在畢赤酵母中的克隆表達(dá)與活性檢定姓名：詹潔申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：熊凌霜吳軍20040530綠色木霉出I，2甘露糖苷酶在畢赤酵母_h的克隆表達(dá)與活性檢定摘嬰綠色木霉旺12甘露糖苷酶在畢赤酵母中的克隆表達(dá)與活性檢定摘要畢赤酵母是現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的、重要的外源基岡表達(dá)宿主。本研究是我室畢赤酵母1二程菌糖基化功能改造T作的起始部分，目的是通過(guò)引入綠色木霉的cc1，2

2、甘露糖苷酶以削減酵母宿主表達(dá)外源糖蛋白N糖鏈甘露糖苷數(shù)目。采用TrizoI試劑法從綠色木霉中提取了總RNA，用RTPcR法從總RNA中擴(kuò)增出0【一l，2甘露糖苷酶(MnsI)的cDNA序列，即mds基因。將mds基因第944位G突變成A，以除去自身xhoI位點(diǎn)，加上內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位標(biāo)簽HDEL序列將該基瀏克隆至酵母表達(dá)載體pPIc9，構(gòu)建成pPIC9aM。將pPIC9dM中的BamHI位點(diǎn)消除后，再把連著Ⅱ交配蚓子前導(dǎo)肽序列的mds切下來(lái)，連

3、接到經(jīng)同樣酶切的pA0815載體上，構(gòu)建成pA0815ⅡM重組質(zhì)粒。選取第80位氨基酸僅有一個(gè)N糖基化位點(diǎn)的人p—IFN作為報(bào)告蛋白。以含有該蛋白基兇的pUcl9B質(zhì)粒為模版擴(kuò)增出p—IFN基因，酶切后連接到pA0815一ⅡA中，構(gòu)建成pA0815一ⅡB重組質(zhì)粒。將pA0815Ⅸ一B經(jīng)BamHl和BgIII雙切后，釋放出Ⅸ一交配闋子前導(dǎo)肽序列和p—IFN基因，連接到經(jīng)BamHI單切的pA0815一ⅡM載體上，構(gòu)建成表達(dá)Mnsl和pIFN

4、的載體pA0815Ⅱ一BM。將pA0815ⅡB和pAO一Ⅱ一BM分別轉(zhuǎn)化酵母宿主Gsll5，得到單獨(dú)表達(dá)p—IFN和表達(dá)pIFN與MnsI的畢赤酵母工程菌，前者命名為PPMBl，后者為PPMGl。分別培養(yǎng)誘導(dǎo)兩種T程菌，SDSPAGE分析表明兩者中B—IFN均得到表達(dá)，且兩種pIFN分子量上可見(jiàn)差異。細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明PPMBl菌中p—IFN活性為36xlO。U，m1，PPMGl中p—lFN為17x】05u／!nJ。采用從凝膠中直接切