1、該文就低氧對(duì)ES細(xì)胞體外增殖和分化作用的影響進(jìn)行了初步研究.1.低氧對(duì)ES細(xì)胞體外增殖的作用 利用細(xì)胞記數(shù)法和BrdU(5-溴脫氧尿苷)摻入的流式細(xì)胞分析檢測(cè)低氧對(duì)ES細(xì)胞的增殖作用,并用RT-PCR和Western-Blot蛋白印跡雜交的方法初步檢測(cè)了ES細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1α)的表達(dá)變化.2.維甲酸(RA)誘導(dǎo)ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化的方法建立 常規(guī)培養(yǎng)的ES細(xì)胞,以3×<'5>/ml的密度接種于細(xì)菌培養(yǎng)皿,在含20

2、％胎牛血清的分化培養(yǎng)基中即可自然分化形成擬胚體(Embryonic body,EB).EB經(jīng)RA的誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞方向分化.該研究中,我們主要采用了自然分化的EB形成4天后,加入RA(終濃度為5×10<'-7>M)誘導(dǎo)4天,即4d+4dRA誘導(dǎo)分化的方法,誘導(dǎo)結(jié)束后,收集EB,單細(xì)胞接種于涂1％明膠的細(xì)胞培養(yǎng)皿中.然后換成無(wú)血清DMEM/F12高糖培養(yǎng)基,同時(shí)添加終濃度為2％的N2神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子培養(yǎng).3.低氧對(duì)EB的形成及向神經(jīng)前體細(xì)胞方向

3、分化的影響 ES細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)液中撤除白血病抑制因子(LIF)和脫離飼養(yǎng)層培養(yǎng),即可自然分化為EB.我們選擇5×10<'4>/ml接種ES細(xì)胞于細(xì)菌培養(yǎng)皿,使之自然分化形成EB,并給予持續(xù)性低氧(3％ O<,2>)4天后,EB形成較常規(guī)氧組減少,且低氧組EB數(shù)隨低氧培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低,即低氧組12天時(shí)形成的EB數(shù)少于8天時(shí),低氧8天時(shí)則少于4天時(shí).為了觀察低氧對(duì)體外誘導(dǎo)ES細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化過(guò)程的影響,我們用nestin標(biāo)記流式

4、細(xì)胞方法檢測(cè)ES細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞的分化情況.綜上所述,低氧對(duì)ES細(xì)胞體外增殖和分化均有影響.就該實(shí)驗(yàn)而言,持續(xù)性低氧抑制ES細(xì)胞的體外增殖,而間隙性低氧(3％ O<,2>)可促進(jìn)ES細(xì)胞的體外增殖;持續(xù)性低氧或間歇性低氧后,ES細(xì)胞內(nèi)HIF-1α mRNA表達(dá)都無(wú)明顯變化;持續(xù)性低氧和間歇性低氧后,低氧和常氧組間無(wú)明顯差異;低氧(3％ O<,2>)抑制ES細(xì)胞體外自然分化形成EB;單純低氧(3％ O<,2>)抑制ES細(xì)胞體外分化為ne