1、[目的]： 臨床上長期大劑量應用糖皮質(zhì)激素(GC)可導致繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，其發(fā)病機理是綜合性因素，其中骨髓微循環(huán)改變和骨髓脂肪分化增強是糖皮質(zhì)激素引起骨質(zhì)疏松癥的重要機制。目前臨床上防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥基本采用治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的藥物。本實驗室開發(fā)研制的新藥丹參骨寶(其主要成分為丹參水溶性成分丹參素、丹參酚B、原兒茶醛)，前期研究發(fā)現(xiàn)其在防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松方面具有肯定療效。為了進一步探討丹參骨寶的作用機制，本實驗應

2、用醋酸潑尼松建立大鼠骨丟失模型，通過觀察大鼠的骨組織形態(tài)計量學、骨密度，骨生物力學、骨髓微循環(huán)密度、骨髓基質(zhì)干細胞PPARγ,的表達以及骨髓脂肪量等指標的變化，分析糖皮質(zhì)激素誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥的骨髓調(diào)控機理，并觀察丹參骨寶是否對骨髓微循環(huán)改變和骨髓脂肪分化有影響，從而探討其防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥作用機制，為從骨髓基質(zhì)干細胞作為靶目標尋找有效對抗糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的藥物提供實驗依據(jù)。 [方法]： 6月齡SPF級雄性SD大

3、鼠64只，隨機分成8組，每組8只?；A組(BAS)未用藥，在實驗開始即處死；對照組(CON)每R給予蒸餾水5ml/kg灌胃；低劑量丹參骨寶組(DSL)每日給予丹參骨寶提取物含5mg丹參素/5ml/kg灌胃：激素組(GC)每日給予醋酸潑尼松混懸液3.5mg/5ml/kg灌胃；激素+羅蓋全組(GC+CAL)每日給予醋酸潑尼松混懸液3.5mg/5ml/kg以及羅蓋全0.045ug/5ml/kg灌胃；激素+低劑量丹參骨寶組(GC+DSL)每日給

4、予醋酸潑尼松混懸液3.5mg/5ml/kg以及丹參骨寶提取物含5mg丹參素/5ml/kg灌胃；激素+高劑量丹參骨寶組(GC+DSH)每日給予醋酸潑尼松混懸液3.5mg/5ml/kg以及丹參骨寶提取物含10mg丹參素/5ml/kg灌胃；激素+丹參注射液組(GC+DSI)每日給予醋酸潑尼松混懸液3.5mg/5ml/kg灌胃以及丹參注射液12ml/kg腹腔注射。以上藥物分為上下午兩次給藥，共計給藥時間為12w。所有動物在實驗結(jié)束前第14、13

5、d及第4、3d各行頸部皮下注射鈣黃綠素進行兩次熒光標記。用藥結(jié)束后心臟抽血處死大鼠，取血清行生化指標檢測，取腎上腺、脾臟、比目魚肌等計算器官指數(shù)，取左側(cè)股骨行脫鈣骨免疫組化染色，測定骨髓微循環(huán)密度(MVD)及PPARγ的表達量，取左側(cè)脛骨不脫鈣，行松質(zhì)骨的骨形態(tài)計量學參數(shù)測量，取右側(cè)股骨行骨生物力學及骨密度檢測。 [結(jié)果]： 1.糖皮質(zhì)激素對大鼠骨量、骨髓微循環(huán)和脂肪分化的影響(1)糖皮質(zhì)激素可以導致大鼠骨丟失：醋酸潑尼

6、松以3.5mg/kg/d灌胃給藥方式作用12w后，大鼠脛骨上段松質(zhì)骨骨小梁面積百分數(shù)比對照組下降43％(P<0.01)，骨小梁厚度下降23％(P<0.01)，而骨小梁分離度(Tb.Sp)顯著增加，具有統(tǒng)計學意義。骨內(nèi)膜面熒光周長百分數(shù)(％E-L.Pm)下降了50.7％，骨礦化沉積率(E-MAR)下降了36.3％，骨形成率(E-BFR/BS)下降了68.4％，均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。同時我們觀察到大鼠體重增長明顯受抑制，免疫器官

7、指數(shù)下降，骨骼肌重量/體重比顯著下降。血清抗酒石酸酸性磷酸酶-5b含量明顯增高(P<0.05)，而堿性磷酸酶含量顯著降低(P<0.01)，并引發(fā)血清甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇以及血清葡萄糖含量升高(P<0.05)。 (2)糖皮質(zhì)激素可以導致大鼠骨髓微循環(huán)密度(MVD)降低：在采甩vWF作為血管內(nèi)皮標記物對血管進行免疫組化染色標記后，可清晰的看到模型組大鼠骨髓微血管呈現(xiàn)管腔狹窄、甚至閉合狀態(tài)，數(shù)量顯著減少，微循環(huán)密度降低，模型組

8、大鼠MVD比對照組降低約19％(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義。 (3)糖皮質(zhì)激素可以導致大鼠骨髓基質(zhì)干細胞PPARγ蛋白的表達量增加，骨髓脂肪面積增加：在對大鼠骨髓基質(zhì)干細胞進行免疫組化PPARγ蛋白特異性染色后，我們發(fā)現(xiàn)模型組大鼠骨髓基質(zhì)干細胞中PPARγ蛋白的表達量明顯增多，表現(xiàn)為細胞漿內(nèi)蛋白著色顯著增強，用計算機LeicaQ550CW圖像分析系統(tǒng)進行灰度測定，模型組大鼠表達PPARγ蛋白的骨髓基質(zhì)干細胞(陽性細胞)胞漿吸

9、光度顯著增強(P<0.01)，顯示糖皮質(zhì)激素能夠促進骨髓基質(zhì)干細胞的成脂分化，具有統(tǒng)計學意義。同時我們觀察到模型組大鼠骨髓腔中脂肪細胞明顯增多，脂肪面積增加，血竇被擠壓閉合。 2.丹參骨寶及羅蓋全、丹參注射液對大鼠骨量與骨髓微循環(huán)、脂肪分化的影響 (1)丹參骨寶對糖皮質(zhì)激素致骨丟失大鼠的防治作用：低、高劑量丹參骨寶均可對抗糖皮質(zhì)激素導致的大鼠脛骨上段松質(zhì)骨骨小梁面積百分數(shù)(％Tb.Ar)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁厚

10、度(Tb.Th)的降低。激素+低劑量丹參骨寶組大鼠骨小梁面積百分數(shù)(％Tb.Ar)是激素組的176％(P<0.01)，并超過了對照組，骨小梁厚度(Tb.Th)是激素組的124％(P<0.01)，接近對照組水平。骨內(nèi)膜面％E-L.Pm是激素組的164.7％(P<0.01)，E-MAR是激素組的137.1％(P<0.05)，E-BFR/BS是激素組的220.4％(P<0.01)。激素+高劑量丹參骨寶組大鼠骨小梁面積百分數(shù)(％Tb.Ar)是激

11、素組的220％(P<0.01)，并超過了對照組，骨小梁厚度(Tb.Th)是激素組的149％(P<0.01)，超過了對照組。骨內(nèi)膜面％E-L.Pm是激素組的191％(P<0.01)，E-BFR/BS是激素組的246.6％(P<0.01)，尚未達到對照組水平。并且低、高劑量丹參骨寶組大鼠的骨小梁分離度(Tb.Sp)較激素組均顯著下降，具有統(tǒng)計學意義。同時丹參骨寶可顯著對抗糖皮質(zhì)激素抑制大鼠體重增長的作用，高劑量丹參骨寶可有效改善糖皮質(zhì)激素所

12、致的免疫器官萎縮現(xiàn)象，并可增加下肢骨骼肌的相對重量(P<0.01)。 激素+低劑量丹參骨寶組大鼠骨髓微循環(huán)密度顯著增高，是激素組的120％(P<0.05)，并且觀察到血管腔多呈開放擴張狀態(tài)，同時骨髓腔脂肪面積明顯減小，骨髓基質(zhì)干細胞中PPARγ,蛋白的表達量也有所減少，陽性細胞吸光度減弱。激素+高劑量丹參骨寶組大鼠骨髓微循環(huán)密度顯著增高，是激素組的132％(P<0.01)，血管明顯擴張，血細胞充盈。骨髓腔脂肪面積顯著減少，骨髓基

13、質(zhì)干細胞中PPARγ,陽性細胞吸光度明顯減弱，具有統(tǒng)計學意義。丹參骨寶在改善骨髓微循環(huán)，逆轉(zhuǎn)骨髓基質(zhì)干細胞成脂分化方面顯示出突出的作用。 (2)羅蓋全、丹參注射液對糖皮質(zhì)激素致骨丟失大鼠的防治作用：激素+羅蓋全組大鼠脛骨上段松質(zhì)骨骨小梁面積百分數(shù)(％Tb.Ar)是激素組的209％(P<0.01)，并超過了對照組，骨小梁厚度(Tb.Th)是激素組的117％(P<0.05)，骨小梁分離度(Tb.Sp)較激素組顯著下降(P<0.01)

14、，并顯著低于對照組。該組％E-L.Pm、E-MAR、E-BFR/BS三項動態(tài)參數(shù)均顯著高于激素組(P<0.01)。但羅蓋全并沒有改善骨髓微循環(huán)狀況，與激素組相比，兩組大鼠骨髓腔中微循環(huán)密度無顯著性差異，羅蓋全組大鼠骨髓腔微循環(huán)擴張不明顯，并且該組大鼠骨髓基質(zhì)干細胞表達PPARγ,蛋白仍較強，顯示羅蓋全未能逆轉(zhuǎn)骨髓基質(zhì)干細胞的成脂分化增多現(xiàn)象。 激素+丹參注射液組大鼠脛骨上段松質(zhì)骨骨小梁面積百分數(shù)(％Tb.Ar)比激素組稍有所增加

15、，但不具有統(tǒng)計學意義，骨小梁厚度(Tb.Th)是激素組的127％(P<0.05)，骨小梁分離度(Tb.Sp)與激素組相比無顯著性差異，脛骨上段骨內(nèi)膜面動態(tài)參數(shù)與激素組相比差異不大，丹參注射液未能顯著對抗糖皮質(zhì)激素抑制骨形成作用。并且該組大鼠骨髓基質(zhì)干細胞表達PPARγ蛋白仍較強，顯示出丹參注射液未能顯著對抗糖皮質(zhì)激素導致的骨髓基質(zhì)干細胞成骨減少、成脂增多。而該組大鼠骨髓腔中微循環(huán)密度顯著增加(P<0.05)，微血管明顯擴張。 [

16、結(jié)論]： 1.本研究表明糖皮質(zhì)激素顯著影響大鼠骨質(zhì)及骨髓微循環(huán)和骨髓基質(zhì)干細胞的成脂、成骨分化。其結(jié)果是明顯減少大鼠松質(zhì)骨骨小梁面積百分數(shù)，骨小梁厚度及骨小梁數(shù)量，增加了骨小梁分離度，并顯著降低了骨內(nèi)膜面熒光周長百分數(shù)、骨礦化沉積率和骨形成率，同時引起骨髓腔微循環(huán)障礙，微血管閉合，微循環(huán)密度降低，而骨髓基質(zhì)干細胞表達PPARγ蛋白顯著增強，骨髓脂肪面積明顯擴大。因此推論，大劑量長期使用糖皮質(zhì)激素導致骨質(zhì)疏松癥的主要機制，可能為激

17、素誘導骨髓基質(zhì)干細胞成脂分化增多、微循環(huán)障礙，進一步導致成骨小梁骨形成減少，骨量降低，最終導致骨質(zhì)疏松。 2.丹參骨寶明顯改善骨髓微循環(huán)，增加微循環(huán)密度，擴張血管，并且有效減弱骨髓基質(zhì)干細胞PPARγ蛋白的表達，抑制其成脂，促進成骨，顯著增加骨量，在對抗糖皮質(zhì)激素所致大鼠骨丟失方面具有顯著防治作用。羅蓋全能夠有效增加松質(zhì)骨骨小梁，但不能改善骨髓微循環(huán)，未能逆轉(zhuǎn)骨髓基質(zhì)干細胞的成脂分化增多現(xiàn)象。丹參注射液能夠有效改善骨髓微循環(huán)，但