1、干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，由于能夠生成功能成熟的終末細(xì)胞，因此在器官組織再生、疾病模型建立、發(fā)育生物學(xué)及藥物研發(fā)等領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景。這其中又以胚胎干細(xì)胞（ESCs）最早受到關(guān)注， ESCs具有無(wú)限的自我更新和向成體所有細(xì)胞進(jìn)行分化的潛能，因此是細(xì)胞治療的良好種子細(xì)胞。然而ESCs應(yīng)用面臨倫理學(xué)的困境，免疫排斥和致畸胎瘤的問(wèn)題。2006年 Yamanaka使用多能性轉(zhuǎn)錄因子 OCT4，SOX2，KLF4和 c

2、-MYC（OSKM）成功的將成纖維細(xì)胞重編程（Reprogramming）為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞（iPSCs）。iPSCs避免了ESCs的倫理學(xué)爭(zhēng)議、免疫排斥問(wèn)題，但依然難以回避致畸胎瘤的風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)使用多種不同的誘導(dǎo)方式使細(xì)胞命運(yùn)發(fā)生轉(zhuǎn)換的譜系重編程技術(shù)（Lineage Reprogramming）在整個(gè)干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，吸引了廣泛的關(guān)注并成為獲取干細(xì)胞和功能成熟細(xì)胞的前沿和極具價(jià)值的技術(shù)策略。與iPSCs及其來(lái)源的細(xì)胞相比，line

3、age reprogramming獲取的細(xì)胞具有多方面的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)。Lineage reprogramming獲取細(xì)胞不經(jīng)過(guò)多能性階段，直接實(shí)現(xiàn)胚層內(nèi)或胚層間的細(xì)胞類型轉(zhuǎn)換，因此不具有成畸胎瘤的潛在風(fēng)險(xiǎn)。由于細(xì)胞發(fā)生直接的命運(yùn)轉(zhuǎn)換，不需要多步的誘導(dǎo)分化，由此獲得的細(xì)胞類型更為均一可控，臨床應(yīng)用也更加安全。此外，Lineage reprogramming同樣具有iPSCs個(gè)體特異性，移植后不具有免疫排斥的優(yōu)勢(shì)。長(zhǎng)期以來(lái)譜系重編程最常用的策

4、略是在成體細(xì)胞中過(guò)表達(dá)靶細(xì)胞譜系特異性的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合相應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，建立靶細(xì)胞的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)化。利用這種方式在內(nèi)，中，外三個(gè)胚層的多個(gè)細(xì)胞類型之間實(shí)現(xiàn)了命運(yùn)轉(zhuǎn)換。然而，目前譜系重編程的主要策略仍然是依賴于病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)的方式，因此會(huì)不可避免的存在病毒載體基因在目的細(xì)胞基因組中的整合，進(jìn)而導(dǎo)致目的細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定，從而造成細(xì)胞移植入體內(nèi)后帶來(lái)長(zhǎng)期的安全性隱患。因此，尋求非整合方式的譜系重編程策略，來(lái)

5、替代病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)表達(dá)，將是譜系重編程走向臨床應(yīng)用的必經(jīng)之路。
　　小分子化合物是一類可自由通透細(xì)胞，性狀穩(wěn)定，質(zhì)量可控，可調(diào)和作用時(shí)間和作用強(qiáng)度，非整合性及無(wú)免疫源性的化合物，因此是一類非常安全的具有巨大臨床應(yīng)用前景的譜系重編程方式。近期，完全使用小分子組合已成功的將小鼠成纖維細(xì)胞重編程到誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞；將人的成纖維細(xì)胞、星狀細(xì)胞重編程為神經(jīng)元，心肌細(xì)胞。然而目前還沒(méi)有將人或鼠的體細(xì)胞重編程到內(nèi)胚層

6、祖細(xì)胞的先例。而且小分子化合物誘導(dǎo)iPSCs產(chǎn)生的機(jī)制才初步闡明，小分子化合物介導(dǎo)譜系重編程的機(jī)制尚不清楚。針對(duì)這些關(guān)鍵的科學(xué)問(wèn)題，我們針對(duì)起始細(xì)胞的選擇、小分子化合物及滋養(yǎng)層細(xì)胞的篩選進(jìn)行了系統(tǒng)研究，最終成功的使用確定的小分子組合在特定的滋養(yǎng)層細(xì)胞的支持下，將人的胃上皮細(xì)胞（hGECs）重編程到誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞階段（hiEndoPCs），并對(duì)hiEndoPCs的生物學(xué)特性以及hGECs向hiEndoPCs譜系重編程的機(jī)制進(jìn)行了深入系統(tǒng)

7、的研究?；谝陨蟽?nèi)容，本課題分為三部分，第一部分建立小分子化合物誘導(dǎo)人胃上皮細(xì)胞重編程為內(nèi)胚層祖細(xì)胞的體系；第二部分鑒定誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞的表型及分化潛能；第三部分是對(duì)人胃上皮細(xì)胞向誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞重編程過(guò)程中的機(jī)制進(jìn)行深入研究，揭示各影響因素的作用機(jī)制。
　　一、小分子化合物誘導(dǎo)人胃上皮細(xì)胞向內(nèi)胚層祖細(xì)胞轉(zhuǎn)換的體系建立
　　我們分離培養(yǎng)人胃和十二指腸來(lái)源的上皮細(xì)胞來(lái)作為譜系重編程的起始細(xì)胞，通過(guò)初步篩選的八個(gè)小分子組合：SB

8、431542+VPA+PD0325901+RG108+BIX01294+Bay K8644+PS48+FBP，并在人消化道來(lái)源的肌成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層的條件下可以將胃上皮（hGECs）或十二指腸上皮細(xì)胞（hDECs）重編程為內(nèi)胚層祖細(xì)胞樣的克隆。我們以能夠出現(xiàn)內(nèi)胚層祖細(xì)胞樣克隆為標(biāo)準(zhǔn)，然后對(duì)重編程的體系—小分子化合物和滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定四個(gè)小分子組合：BIX01294+Bay K8644+RG108+SB431542（BBR

9、S）為最優(yōu)的小分子組合。由于滋養(yǎng)層細(xì)胞—人胃肌成纖維細(xì)胞(GSEMFs)的獲取最為便利，因此我們確立了重編程最優(yōu)的體系是BBRS+GSEMFs，在這樣的體系中重編程的效率為~5％。我們也發(fā)現(xiàn)能夠?qū)崿F(xiàn)重編程的最少小分子組合是 SB431542。此外，我們還證實(shí)了hiEndoPCs來(lái)源于NCAM陽(yáng)性的hGECs，實(shí)現(xiàn)了起始細(xì)胞的精確定位。
　　二、誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞的表型鑒定及分化潛能研究
　　我們首先檢測(cè)了常見(jiàn)的內(nèi)胚層祖細(xì)胞特征

10、性的轉(zhuǎn)錄因子 FOXA2、SOX9、HNF1B、PDX1、GATA4，其他干/祖細(xì)胞特征性蛋白包括CXCR4、EPCAM、LGR5、CK19以及胃上皮特異性的標(biāo)志MUC6、GASTRIN等在hiEndoPCs中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與hGECs相比內(nèi)胚層標(biāo)志性的基因在hiEndoPCs中明顯上調(diào)，而胃特異性的基因則不表達(dá)，初步證實(shí)了 hGECs向內(nèi)胚層祖細(xì)胞重編程的成功。表觀遺傳分析也顯示重編程后細(xì)胞發(fā)生了顯著改變，具備了內(nèi)胚層祖細(xì)胞的分子特

11、征。對(duì) hiEndoPCs的發(fā)育階段進(jìn)行精確定位，深度測(cè)序的結(jié)果顯示 hiEndoPCs處于hESCs來(lái)源的原始消化管（PGT）和前腸后段（PFG）這兩個(gè)內(nèi)胚層發(fā)育階段之間，且更接近PFG。此外，hiEndoPCs具有干細(xì)胞微觀水平的特征并能進(jìn)行4-6次的傳代擴(kuò)增。由于發(fā)育過(guò)程中內(nèi)胚層祖細(xì)胞具有向胰腺、肝臟、腸、肺和甲狀腺等內(nèi)胚層器官進(jìn)行分化的潛能，因此我們使用相應(yīng)的誘導(dǎo)分化條件發(fā)現(xiàn)hiEndoPCs同樣具有形成功能性胰腺β細(xì)胞、肝細(xì)胞

12、、腸道細(xì)胞、肺細(xì)胞和甲狀腺細(xì)胞的能力。
　　通過(guò)對(duì) hiEndoPCs的表型分析、生物信息學(xué)分析以及內(nèi)胚層分化潛能的評(píng)價(jià)，我們明確證實(shí)了hiEndoPCs的內(nèi)胚層祖細(xì)胞特性以及hGECs向hiEndoPCs重編程的成功。
　　三、胃上皮細(xì)胞向誘導(dǎo)內(nèi)胚層祖細(xì)胞重編程的機(jī)制研究
　　由于在我們的重編程體系中，小分子化合物和滋養(yǎng)層細(xì)胞這兩個(gè)因素是不可或缺的，因此我們首先對(duì)小分子可能的作用機(jī)制進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn) TGF-β信號(hào)通

13、路的抑制是必須的，也是能夠保證重編程成功的最少小分子組合，也就是說(shuō)TGF-β信號(hào)通路抑制介導(dǎo)的上皮特性的維持在重編程的過(guò)程中是必須的，然而我們發(fā)現(xiàn)早期的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）和隨后的間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換（MET）也存在于重編程的過(guò)程中。重編程的另一個(gè)關(guān)鍵因素是滋養(yǎng)層細(xì)胞的作用，對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞的分泌蛋白表達(dá)譜分析顯示促進(jìn)細(xì)胞周期加速的蛋白高表達(dá)，在滋養(yǎng)層細(xì)胞的作用下 hGECs細(xì)胞周期明顯加快，提示了細(xì)胞周期的加速有助于重編程的發(fā)生。此外Wnt信號(hào)