1、近年來(lái)，結(jié)腸癌發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，成為人類高發(fā)惡性腫瘤之一。手術(shù)是其治療的首選方法，但術(shù)后各種并發(fā)癥發(fā)生較多，有效的臨床藥物也有所欠缺。隨著結(jié)腸癌患者人數(shù)增加，死亡率較高，抗結(jié)腸癌藥物的研發(fā)越來(lái)越受到科研工作者的重視。
　　五環(huán)三萜類化合物的抗腫瘤活性已經(jīng)獲得廣泛認(rèn)可，2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸(TEOA)，是從畬族習(xí)用抗腫瘤中草藥毛花獼猴桃根中提取出的五環(huán)三萜類化合物。我們課題組的前期研究結(jié)果及相

2、關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道證明了TEOA具有明顯的抗腫瘤、抗炎、抗病毒作用，但關(guān)于其作用機(jī)理的研究鮮有報(bào)道。
　　自噬性細(xì)胞死亡通常被稱為Ⅱ型程序性死亡，通過(guò)自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，將包裹的細(xì)胞器和蛋白消化、降解、吞噬。探究藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡作用機(jī)制，對(duì)尋找治療癌癥臨床藥物有重要意義。
　　本研究選取三株不同人源的結(jié)腸癌細(xì)胞為研究對(duì)象，探究TEOA抗人結(jié)腸癌細(xì)胞作用機(jī)制，進(jìn)而為T(mén)EOA的新藥開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用提供更深入

3、的理論依據(jù)。
　　1.TEOA對(duì)三株人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖抑制作用及形態(tài)學(xué)觀察
　　本章以三株不同類型不同蛋白表達(dá)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620、SW480、HCT116細(xì)胞為研究對(duì)象，采用MTT法考察不同藥物濃度、不同作用時(shí)間TEOA對(duì)人結(jié)腸癌的生長(zhǎng)抑制率;利用平板克隆實(shí)驗(yàn)考察TEOA對(duì)人結(jié)腸癌SW620、SW480、HCT116細(xì)胞增殖能力的影響;運(yùn)用結(jié)晶紫染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察TEOA對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響。結(jié)果顯示

4、，TEOA對(duì)三株人結(jié)腸癌SW620、SW480、HCT116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制呈劑量依賴性，能夠抑制三株結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)三株人結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW620、SW480、HCT116)產(chǎn)生不同程度的空泡現(xiàn)象。
　　2.TEOA抗人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞作用機(jī)制探討
　　采用流式細(xì)胞儀PI/AnnexinⅤ-FITC雙染色法測(cè)不同TEOA濃度作用后人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞凋亡率;利用western blot技術(shù)檢測(cè)凋亡標(biāo)志性蛋白cas

5、pase-9和PARP蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示TEOA能引起人結(jié)腸癌SW620早凋和晚凋，并且凋亡率呈現(xiàn)劑量依賴性;TEOA激活了凋亡標(biāo)志性蛋白capase-9和PARP蛋白的剪切，并且蛋白表達(dá)量隨TEOA劑量的增加而逐漸增加。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以初步說(shuō)明TEOA能誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞凋亡。
　　采用MDC染色法檢測(cè)不同藥物濃度TEOA作用后，人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞產(chǎn)生的自噬小體數(shù)量;運(yùn)用western blot檢測(cè)自噬標(biāo)志性蛋白

6、LC3-Ⅱ及p62表達(dá)量;結(jié)果顯示，藥物處理后人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞內(nèi)成熟自噬小體的數(shù)量隨TEOA濃度的增高而增加;TEOA明顯促進(jìn)了自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ及p62蛋白的表達(dá)，并具有劑量依賴性。利用MTT、流式細(xì)胞儀PI/AnnexinⅤ-FITC雙染色法、we stern blot考察加入自噬抑制劑3-MA后，人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞存活率、凋亡率以及凋亡標(biāo)志蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，細(xì)胞自噬被抑制后，人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞存活率、凋亡

7、率以及凋亡標(biāo)志蛋白PARP表達(dá)水平都沒(méi)有明顯提高。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明TEOA引發(fā)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。
　　運(yùn)用western blot技術(shù)檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路上相關(guān)蛋白(PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP)及線粒體自噬相關(guān)蛋白（p62、 Parkin、 PINK1）的表達(dá)水平，利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)檢測(cè)。結(jié)果顯示TEOA能夠使p-PERK、p-eIF2α、

8、CHOP蛋白表達(dá)量上調(diào)并且呈現(xiàn)劑量依賴性，PERK、 eIF2α蛋白表達(dá)量不變;加入自噬抑制劑3-MA后，PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP蛋白表達(dá)量變化不明顯;說(shuō)明TEOA可劑量性提高p62、Parkin、PINK1蛋白表達(dá)水平，自噬抑制后，線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量變化趨勢(shì)不明顯;流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示TEOA藥物作用后，人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞內(nèi)ROS升高，伴隨劑量依賴性;根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)TEOA通過(guò)內(nèi)質(zhì)

9、網(wǎng)應(yīng)激PERK/eIF2α/CHOP通路及ROS介導(dǎo)的線粒體自噬p62/Parkin/PINK1通路誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。
　　3.TEOA抗人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞作用機(jī)制初步探索
　　本部分利用免疫熒光顯微鏡檢測(cè)不同藥物濃度TEOA作用后，人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)被MDC染色的自噬小體的數(shù)量;Western blot檢測(cè)自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ、p62蛋白表達(dá)量變化及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示

10、，TEOA濃度越高，人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，自噬小體越多;TEOA能夠提升LC3-Ⅱ、p62蛋白表達(dá)水平;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、p-PERK和p-eIF2α蛋白表達(dá)水平提高，而PERK和eIF2α總蛋白表達(dá)量不變;綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測(cè)TEOA誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞發(fā)生自噬，TEOA濃度越高，細(xì)胞自噬程度越大;TEOA可能是通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78/P ERK/e IF2α/CHOP通路誘發(fā)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞