1、蘿卜硫素（1-異硫氰酸-4-甲磺?；⊥椋⊿FN）是迄今為止蔬菜中所發(fā)現(xiàn)的抗癌效果最好的天然活性物之一，美國、日本等國家從20世紀50年代就開始研究SFN的性質、制備方法、腫瘤抑制機制及生理功能等，由于其具有多種抑瘤機制且具有分子量小、治療指數(shù)好等優(yōu)點，SFN現(xiàn)已成為重點研究的抗腫瘤藥候選藥物。我國關于SFN的研究較少，關于其抑瘤活性的研究幾無報道。本論文利用MTT法、熒光顯微術和流式細胞術等方法研究了SFN對人膠質母細胞瘤細胞A17

2、2、非小細胞肺癌細胞株H460、肝癌細胞株HepG2、人肺癌細胞株A549生長的影響。對人膠質瘤細胞A172的實驗結果表明，較低濃度的蘿卜硫素能夠誘導A172發(fā)生凋亡和調控細胞周期，并主要以后者為主。而蘿卜硫素對H460增殖抑制其所需濃度較高，并且主要是通過誘導凋亡通路來實現(xiàn)?？梢?，SFN對于不同瘤細胞株其增殖抑制機制不同。此外，SFN對A549和HepG2也有增殖抑制作用，結合本課題組前期MTT試驗結果：SFN對瘤細胞株HeLa、HL

3、-60、CNE、PC3及P388細胞等均有顯著的體外增殖抑制活性且IC50值較低，說明SFN具有很好的新藥開發(fā)潛力。
　　 硫代葡萄糖苷酶（myrosinase，EC3.2.3.1，簡稱硫苷酶）又稱黑芥子酶，是黑芥子苷（硫代葡萄糖苷的一種）水解生成SFN過程的關鍵酶。在生命進化歷程中，硫苷酶基因往往以多個拷貝的形式存在于物種基因組中并在遺傳過程中被各物種保留，最終形成了一個相當復雜的基因家族。在甘藍型油菜中，該基因的研究已非常廣

4、泛，而在同為十字花科植物的西蘭花中其研究卻少見報道。因此，對西蘭花硫苷酶基因進行克隆并對其異源表達進行研究對進一步研究該植物的防衛(wèi)機理和硫苷活性水解產(chǎn)物的獲得具有重要的學術意義和實際應用價值。
　　 硫苷酶在十字花科植物中的重要功能對硫苷酶基因結構保守性的要求與硫苷酶編碼基因的多基因存在及在進化中被保留的現(xiàn)象說明硫苷酶編碼基因序列存在相當保守的序列模體和變異相當活躍的區(qū)域。因此，利用現(xiàn)有基因數(shù)據(jù)庫中不同物種的硫苷酶編碼序列進行同

5、源性比較，探詢硫苷酶編碼基因的保守序列，設計擴增兩蘭花硫苷酶編碼基因保守序列的引物，結合利用RACE技術，在西蘭花中獲得硫苷酶基因的全長序列是可行的。本實驗以西蘭花幼苗為材料，根據(jù)同源序列法PCR擴增硫苷酶特異cDNA片段，進一步用3’RACE和5’RACE分別擴增cDNA3’端序列和5’端序列，經(jīng)序列拼接獲得西蘭花硫苷酶全長cDNA序列。利用在線蛋白質分析系統(tǒng)對其編碼的氨基酸序列進行結構特征分析，NCBI CDD數(shù)據(jù)庫中進行保守結構域

6、查找，在SWISS-MODEL進行在線蛋白同源模建，MEGA3.1構建NJ系統(tǒng)樹。結果得到一全長1830bp硫苷酶cDNA，含有一個1641bp的ORF及31bp的5’端非翻譯區(qū)和158bp的3’端非翻譯區(qū)，命名為BoMyr2（GenBank登錄號為ELJ004075）。編碼氨基酸序列含有20氨基酸長度的信號肽并含有9個天冬酰胺N末端糖基化位點，編碼的蛋白分子量（Mw）約為62.2kD，等電點（pI）為8.71；BoMyr2推測氨基酸序

7、列含有糖基水解酶家族1特有的糖基水解酶結構域，其編碼蛋白與PDB庫中自芥硫苷酶有相似的三維結構，具有明顯的β/α（TIM）桶結構；BoMyr2應歸為硫苷酶基因家族的MB亞族。
　　 由于硫苷酶是一類非組織型表達的蛋白，通常在植物體內含量較低，并且由MB亞族基因編碼的硫苷酶在植物體內往往與硫苷酶結合蛋白形成復合物，因此，從植物源出發(fā)通過分離純化獲得大量的硫苷酶很難實現(xiàn)。西蘭花硫昔酶的原核表達現(xiàn)無資料公開報道。根據(jù)RACE結果設計引

8、物擴增硫苷酶成熟蛋白編碼區(qū)序列，以pGEX-4T-1為載體，在大腸桿菌BL21中進行GST融合蛋白表達。經(jīng)SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)在90kD左右處有一明顯的蛋白條帶。預測的硫苷酶成熟蛋白分子量為60.17kDa，而融合蛋白N端融合標簽蛋白分子量約為26kDa，表達產(chǎn)物與與預期大小一致。說明硫苷酶成熟蛋白在BL21中融合表達成功。不同時間點GST融合蛋白表達比較發(fā)現(xiàn)，融合蛋白的誘導表達具有累積作用，在誘導4h后，蛋白表達量己較高，到6小

9、時達最大。融合蛋白活性測定發(fā)現(xiàn)，表達的融合蛋白基本沒有催化底物sinigrin的能力，即融合蛋白缺乏硫苷酶活性，有必要進行進一步的凝血酶酶切加工以及蛋白變性、復性等方面的研究。
　　 蛋白數(shù)據(jù)庫（PDB）中三維結構已闡明的硫苷酶均存在糖基化現(xiàn)象，利用不同模型對GenBank中已登錄的硫苷酶全長cDNA序列進行信號肽預測發(fā)現(xiàn)，其編碼基因均含有一段典型信號肽編碼序列，說明硫苷酶蛋白在黑芥子酶細胞ER膜上合成后轉運到黑芥子酶顆粒的過程

10、中發(fā)生了糖基化反應。畢赤酵母（Pichia pastoris）具有對外源蛋白進行適度糖基化修飾的作用。因此，進一步將西蘭花BoMyr2成熟蛋白編碼序列重組到Pichiapastoris分泌型表達載體pPIC9K上，得到重組酵母表達載體pPIC9K-BoMyr2，經(jīng)Sac I線性化后電轉導入Pichia pastoris KM71。菌落PCR以及重組酵母的SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，硫苷酶在Pichia pastoris中進行分泌表達，表達

11、蛋白分子量約為65kDa。酶活測定顯示，表達較好的6株菌株（13＃、15＃、5＃、21＃、41＃、29＃、36＃），13＃、15＃重組菌株其發(fā)酵液上清硫苷酶酶活可達1.7～1.9U/ml，而36＃菌株其活性為O.75U/ml。硫苷酶比活力分析發(fā)現(xiàn)，同樣是13＃、15＃重組菌株比活力較高，相關分析發(fā)現(xiàn)兩者相關性達95％，說明發(fā)酵上清的蛋白量可基本反映外源蛋白的表達情況和硫苷酶活性。
　　 將酶活相對較高的13＃菌株，進一步進行搖瓶

12、發(fā)酵研究。結果表明，在BMMY培養(yǎng)基中，pH6.0、1.0％甲醇濃度可以獲得較好的表達水平；0.05％的油酸和0.1％的表面活性劑吐溫20可以少量提高硫苷酶的表達。誘導培養(yǎng)36小時后發(fā)酵上清中硫苷酶總酶活較好，適于發(fā)酵液的回收。重組畢赤酵母在合適條件下其發(fā)酵上清酶活可達到3U/ml左右。
　　 MA基因亞族編碼的自由態(tài)硫苷酶已得到廣泛深入的研究，而關于MB基因亞族編碼的硫苷酶因在植物體內的表達情況、存在形式等因素其生化特性至今很