1、目的:本研究應用兩步離心法制備PRP，通過分析PRP中血小板、白細胞和生長因子的濃度，計算回收率和富集系數(shù)，并做相關性分析，探討PRP制備方法的實用性和穩(wěn)定性。
　　關節(jié)退變臨床產(chǎn)生關節(jié)疼痛，活動受限和關節(jié)畸形等癥狀，是導致患者長期痛苦和身體殘疾的常見原因，不僅極大地影響了人們的生活質(zhì)量，導致人力資源的喪失，也給家庭和社會帶來沉重負擔。傳統(tǒng)方法存在諸多弊端和生物學技術不斷取得新進展的今天，PRP技術為我們治療骨性關節(jié)炎提供了一種嶄

2、新的治療思路和方法。通過關節(jié)內(nèi)注射的方法，將PRP與玻璃酸鈉作比較，探討關節(jié)內(nèi)注射PRP治療關節(jié)軟骨退行性變的安全性和療效。
　　慢性難愈性創(chuàng)面的治療一直是醫(yī)學研究的熱點，傳統(tǒng)的傷口換藥、清創(chuàng)手術、負壓真空吸引和局部應用各種藥物等治療，能清除局部感染灶或壞死組織，減少潰瘍分泌物，但仍有許多創(chuàng)面難以愈合，我們采用局部噴灑PRP的方法治療慢性難愈性創(chuàng)面，探索PRP治療慢性難愈性創(chuàng)面的安全性和療效，同時通過體外實驗評價其抗感染作用。

3、r>　　方法:取30例成年健康自愿者捐獻的外周血，男女各15例;年齡24～76歲，平均47歲。用預先裝有5 mL枸櫞酸鈉注射液的50 mL一次性注射器以18 G針頭于每例志愿者肘前靜脈取血40 mL。搖勻后，取1 mL作血細胞分析，4 mL作生長因子濃度測定;剩余40 mL注入PRP制備套裝離心管中，于嚴格無菌狀態(tài)下制備PRP。根據(jù)血液中各組分的沉降系數(shù)不同，以離心半徑15 cm、2000 r/min離心10 min后，全血分為3層，上

4、層為上清液，下層為紅細胞，兩層交界處一淺黃色層即PRP層。分別將1 mL抗凝靜脈血和制備的PRP采用全自動血液分析儀進行血常規(guī)分析，測定血小板及白細胞濃度，并計算PRP中血小板和白細胞濃度變異系數(shù)。計算PRP中血小板或白細胞回收率和富集系數(shù)，回收率=PRP中血小板或白細胞總數(shù)/全血中血小板或白細胞總數(shù)×100％，富集系數(shù)=PRP中血小板或白細胞濃度/全血中血小板或白細胞濃度。分別測定男、女自愿者PRP血小板及白細胞濃度。生長因子濃度測定

5、于4 mL抗凝靜脈血中加入0.4 mL凝血酶和氯化鈣混合物(2000 U凝血酶中加入5 mL5％氯化鈣溶液)，3 min后血液凝聚成凍膠狀，常溫下靜置1h后，同上法離心10 min，吸取上清液轉移到凍存管中。將制備的PRP采用相同方法制備得到富含生長因子的上清液。取制備的全血及PRP上清液，按照ELISA試劑盒說明測定PDGF、TGF-β及VEGF濃度。
　　將30例慢性關節(jié)疼痛或腫脹（不得少于4月），X或MRI有退行性變表現(xiàn)的膝

6、關節(jié)軟骨退行性變患者納入研究。根據(jù)患者的年齡、性別、體重指數(shù)以及Kellgren&Lawrence骨性關節(jié)炎分級情況將30例病人分配到PRP組（試驗組）和透明質(zhì)酸鈉(Sodium hyaluronate，SH)。試驗組15例患者（15膝），每次關節(jié)內(nèi)注射3.5mLPRP，對照組15例患者（15膝），每次關節(jié)內(nèi)注射透明質(zhì)酸鈉(Sodiumhyaluronate，SH)2 mL。所有患者每3周注射一次，連續(xù)3次為一個療程。通過記錄治療過程中

7、相關不良事件的數(shù)量、發(fā)生時間、嚴重程度、持續(xù)時間和處理結果來評估該治療方法的安全性。通過比較注射前和3、4、6月隨訪時的國際膝部文件委員會(IKDC)主觀膝部評估表、WOMAC評價表、Lequesne指數(shù)評估表來評估其臨床療效。
　　將符合選擇標準的21例慢性難愈性創(chuàng)面患者納入本項研究。男8例，女13例;年齡48～78歲，平均58.5歲。開放原始創(chuàng)面，徹底清創(chuàng)，按照1∶10的比例將制備的2～8mL自體PRP與促凝劑（2000U凝血

8、酶中加入5mL5％氯化鈣溶液）同時緩慢噴灑入創(chuàng)面并盡量覆蓋所有創(chuàng)面。3min后創(chuàng)面表面形成一層PRP凝膠，取大小合適的無菌透明薄膜覆蓋于創(chuàng)口，四周密封確保PRP不流失，術后1周內(nèi)建議患者盡量減少創(chuàng)面臨近關節(jié)的活動量。術后可視情況更換無菌敷料，一般1周左右查看創(chuàng)面。囑患者避免用手碰觸患處，根據(jù)創(chuàng)面情況決定PRP使用的次數(shù)。采用滴注無菌生理鹽水的方法測定傷口體積和計算創(chuàng)面覆蓋率，我們將3個月內(nèi)的創(chuàng)面愈合情況分為如下五個等級:Ⅰ級完全愈合，覆

9、蓋率100％;Ⅱ級明顯愈合，覆蓋率在75％-100％之間;Ⅲ級有效愈合，覆蓋率在50％-75％之間;Ⅳ級部分有效愈合，覆蓋率在25％-50％之間;Ⅴ級無效愈合，覆蓋率低于25％。對于3個月后沒有痊愈的患者，在征求他們同意的情況下給予再次PRP治療或繼續(xù)觀察治療。于治療前及3月隨訪結束時分別行創(chuàng)面內(nèi)分泌物細菌培養(yǎng)，對比觀察。選取創(chuàng)面感染最常見的金黃色葡萄球菌作為實驗菌株，分別在PRP凝膠及PRP等培養(yǎng)基中孵育，分別于2、4、6、8、12、

10、24h取樣計數(shù)菌落數(shù)，繪制時間-抑菌曲線圖，計算細菌減少率。
　　結果:研究發(fā)現(xiàn)全血和PRP中血小板濃度分別為(131.40±29.44)×109/L和(819.47±136.32)×109/L，比較差異有統(tǒng)計學意義（t=-27.020，P=0.000）;PRP中血小板回收率為60.85％±8.97％，富集系數(shù)為6.40±1.06。全血和PRP中白細胞濃度分別為(5.57±1.91)×1012/L和(32.20±10.42)×10

11、12/L，比較差異有統(tǒng)計學意義（t=-13.780，P=0.000）;PRP中白細胞回收率為58.30％±19.24％，富集系數(shù)為6.10±1.93。PRP中血小板濃度和白細胞濃度分別與全血中血小板濃度(r=0.652,P=0.000)和白細胞濃度(r=0.460，P=0.011)成正相關。男性組和女性組PRP中血小板濃度和白細胞濃度比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。PRP中PDGF、TGF-β、VEGF濃度分別為(698.15±

12、64.48)、(681.36±65.90)、(1071.55±106.04) ng/mL，是全血的(5.67±1.18)、(6.99±0.61)、(5.74±0.83)倍。PRP中PDGF濃度(r=0.832,P=0.020)、TGF-β濃度(r=0.835,P=0.019)、VEGF濃度(r=0.824,P=0.023)均與PRP中血小板濃度成正相關。
　　在關節(jié)軟骨退變部分的臨床研究中未發(fā)生關節(jié)內(nèi)感染、肌肉萎縮、深靜脈血栓、發(fā)

13、熱、血腫和異常組織增生等不良反應，與對照組相比試驗組未表現(xiàn)出有更長的不良反應持續(xù)時間(P=0.862)，所有出現(xiàn)不良反應的患者在得到合理治療后都在4天內(nèi)恢復到治療前狀態(tài)。試驗組患者的評分在6個月內(nèi)保持了穩(wěn)定，而對照組只在前4個月內(nèi)保持了穩(wěn)定，在第6個月隨訪時就表現(xiàn)出明顯的減低(PIKDC=0.003,PWOWAC=0.048,PLequesne=0.002)。在前4個月內(nèi)試驗組患者的狀態(tài)改善并不優(yōu)于對照組(P＞0.05)，但在隨訪到6月

14、時IKDC評分和Lequesne指數(shù)的改變提示此時試驗組患者膝關節(jié)狀態(tài)優(yōu)于對照組(PIKDC=0.000，PLequesne=0.013)。短期結果證實關節(jié)內(nèi)注射PRP治療關節(jié)軟骨退行性病變是安全的，其長期療效可能會優(yōu)于透明質(zhì)酸鈉。
　　在難愈性創(chuàng)面的研究中未發(fā)生創(chuàng)面感染加重、菌血癥、局部異常組織增生等不良反應。治療后第1、2、4周隨訪時創(chuàng)面覆蓋率分別為(55.1±22.6)％、(72.0±16.2)％，(84.3±14.0)％，

15、周間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明在治療的4周內(nèi)，創(chuàng)面處于持續(xù)修復狀態(tài)。3個月隨訪時，創(chuàng)面體積為(1.5±1.8) mL，創(chuàng)面平均覆蓋率為85.6％，治愈率為57.1％，治療的有效率和患者主觀滿意率均為95.23％。體外抑菌結果顯示PRP凝膠抗菌作用明顯，細菌數(shù)量于孵育4h時降至最低。
　　結論:結合二次離心法使用PRP制備套裝可以穩(wěn)定地制備出富含高濃度血小板、白細胞和生長因子的PRP。關節(jié)內(nèi)注射PRP為臨床治療膝關節(jié)退行

16、性變提供了一種可能的選擇，但是需要大樣本的隨機對照研究的長期隨訪結果以進一步證實其安全性和療效。PRP不但能有效安全的促進慢性難愈性創(chuàng)面的愈合，并有潛在的抗感染作用。
　　意義:通過對PRP細胞成分的檢測、抗菌活性的測定等多個層面的研究，確定了制備PRP的最佳離心時間及離心力，為PRP在骨科的臨床應用提供理論依據(jù)和現(xiàn)實指導。利用自體PRP來解決關節(jié)軟骨損傷和難愈性創(chuàng)面修復的難題，無免疫排斥反應，制備簡便，費用低廉，能有效地縮短治療