1、研究背景和目的隨著人類基因組計劃的完成，生命科學進入了后基因組時代。研究表明，編碼蛋白的基因總數不到3萬個，遠遠少于最初預計的10萬個左右。動植物基因組的非蛋白質編碼區(qū)存在大量非編碼RNA基因，約占整個基因組的98％，如此龐大的區(qū)域擔負著基因的表達調控等重要功能。近年來發(fā)現(xiàn)的非編碼小RNA主要包括小干擾RNA(small interfering RNAs, siRNAs)、微RNA(microRNAs, miRNAs)、重復關聯(lián)小RNA

2、(repeat associated small interfering RNAs, rasiRNAs)和piwi 交互RNA(piwi-interacting RNAs, piRNAs)。目前人們對非編碼RNA，尤其是microRNA在心血管、腫瘤、干細胞等領域的研究取得了長足的進步，極大的豐富和拓展了人們對這些重要生命科學領域的認知。本課題旨在選擇血管內皮細胞高表達的microRNA對其進行相關表達譜分析和功能研究，探尋microR

3、NA可能參與的心血管相關病理生理過程，進一步闡明諸如動脈粥樣硬化、腫瘤血管生成等的發(fā)病機制，為今后運用RNA干擾治療心血管疾病提供新的靶點。
　　 研究方法
　　 提取人臍靜脈內皮細胞(Human UmbilicAlVascular EndotheliAlCell, HUVEC)的總RNA，變性膠富集大小約19-25個核苷酸大小的RNA后在3’和5’端分別連接合適的連接子，經過RT-PCR 反應擴增后進行T-A 克隆，重

4、組質粒送商業(yè)測序，最終構建HUVEC的miRNA文庫。運用Northern Blot 檢測文庫中miRNA的表達譜：15％變性膠分離總RNA，電轉移至尼龍膜，紫外線交聯(lián)后運用Γ32p-ATP 標記的寡核苷酸探針進行雜交，然后運用X 膠片-80℃顯影。運用實時熒光定量RT-PCR 檢測miRNA在組織和細胞系中的相對表達量。將包含miR-126基因的EGFL7的第7個內含子連同相鄰的外顯子克隆至pEGFPc1質粒并轉染293T細胞進行表達

5、，運用PCR和NorthernBlot 檢測轉錄產物以確定miR-126的生物來源和成熟機制。運用生物信息學工具PicTar、TagetScan5.1、miRanda、miRBase 預測miRNA的靶基因。將預測靶基因的3’UTR 克隆入Pgl3-control的XbaI 位點構建螢光素酶報告基因，與miRNA mimics和對照mimics 共轉染293T細胞，通過分析螢光素酶的表達量以初步篩選這些內皮高表達miRNA的靶基因。進一

6、步通過Western Blot在細胞中確認miRNA對其靶基因的調控關系。干預HUVEC中miR-155 或miR-221/222的表達，血管緊張素(Angiotensin,Ang)II 刺激HUVEC后運用BCECF-AM 標記的Jurkat T細胞檢測HUVEC與單個核細胞的黏附性。采用細胞劃痕法檢測miRNA對AngII 刺激下HUVEC 遷移的影響。數據統(tǒng)計分析：兩組間數據比較采用student t 檢驗，多組間數據比較采用AN

7、OVA 方差分析，P<0.05代表結果存在統(tǒng)計學意義。
　　 研究結果
　　 成功建立了HUVEC的microRNA文庫，發(fā)現(xiàn)miR-26a, miR-26b, miR-126, miR-155等在文庫中的克隆數目相對較多。Northern Blot 結果確認miR-126, miR-155和miR-221在HUVEC中高表達。其中miR-126在小鼠各器官組織中普遍表達并且在心臟和肺組織中高表達，然而在細胞水平，miR

8、-126 特異表達于內皮細胞而在人冠狀動脈平滑肌細胞(Human Coronary Artery Smooth Muscle Cell，HCASMC)以及293T、Hela、小鼠胚胎成纖維細胞中均無表達。miR-155, miR-221和miR-222在血管平滑肌細胞也呈高表達但在Jurkat T, HEK293和Hela細胞中表達豐度很低或檢測不出。
　　 miR-126 前體序列和基因組位置在人、大鼠和小鼠基因組中保守。mi

9、R-126基因位于EGFL7的第7個內含子中，Real-Time PCR 顯示EGFL7與miR-126 有著相似的表達譜。包含miR-126基因的內含子在工具細胞中能夠被識別并剪切修飾形成成熟的具有功能的miR-126，而其宿主基因EGFL7 也能夠拼接形成Mrna，兩者的成熟和表達互不影響。生物信息學預測結果表明，VEGF, RGS3, v-CRK, PIK3R2和EGFL7的3’UTR與miR-126的5’端“種子序列”有較佳的匹

10、配位點。螢光素酶報告基因篩選和Western Blot 結果顯示，VEGF和PIK3R2是miR-126 共同的靶基因。進一步，在MCF-7細胞中過表達miR-126 可以通過對VEGF和PIK3R2的調控而降低AKT 磷酸化水平。此外，miR-126在乳腺癌組織中表達明顯下調而VEGF, PIK3R2的表達量以及AKT 磷酸化水平均有明顯升高。
　　 生物信息學分析表明ETS-1的3’UTR 區(qū)存在多個miR-155和miR-

11、221/222 可能同時調控的靶點。螢光素酶報告基因和Western Blot 結果證實miR-155和miR-221/222能夠同時調控靶基因ETS-1的表達。miR-155 還能調控AngII的1型受體在蛋白水平的表達。AngII能夠刺激HUVEC上調轉錄因子ETS-1及其下游基因VCAM1, ICAM1,MCP1和 FLT1Mrna等的表達，同時還能增強HUVEC與Jurkat T細胞的粘附作用以及HUVEC的遷移活性。然而在HU

12、VEC中過表達miR-155 或miR-221/222 并以AngII 刺激后，與對照相比，轉錄因子ETS-1及其下游基因VCAM1, MCP1和 FLT1Mrna等的表達均有不同程度的逆轉，ICAM1Mrna 無明顯變化。同時，過表達miR-155 或miR-221/222的HUVEC對Jurkat T細胞的粘附作用明顯降低。此外，過表達miR-155 還能降低AngII 誘導的HUVEC 遷移活性，而miR-221/222 無此作用

13、。研究結論(1) 成功建立了HUVEC的miRNA文庫，確認miR-126在HUVEC特異表達，miR-155，miR-221/222在HUVEC 高表達。
　　 (2) miR-126 來源于EGFL7基因的第7個內含子并且miR-126與其宿主基因的成熟和修飾互不干擾。VEGF和PIK3R2 均為miR-126的靶基因。在MCF-7細胞系中，miR-126能夠降低VEGF/PI3K/AKT通路的活性。在乳腺癌組織中，miR-

14、126的表達降低而VEGF，PIK3R2的表達以及AKT 磷酸化水平均明顯升高。
　　 (3) ETS-1是miR-155和miR-221/222 共同的靶基因。miR-155 還能夠調控AT1R基因的表達。miR-155和miR-221/222 均能通過調控ETS-1及其下游基因的表達而減輕AngII 誘導的內皮細胞炎癥反應。同時miR-155 還能夠抑制AngII 誘導的內皮細胞遷移活性。
　　 (4) 一個miRN