1、目的:構建人canstatin重組分泌型真核表達載體，轉染CHO-K1細胞，初步鑒定該細胞培養(yǎng)液抑制血管生成的活性。方法:用RT-PCR方法從新鮮人胎盤臍帶組織中釣取canstatin全編碼區(qū)cDNA。將該片段重組入pUCm-T克隆載體中，重組載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和DNA序列分析。從pUCm-T/canstatin克隆載體中，將人canstatincDNA亞克隆入分泌型真核表達載體pSecTag2B，構建含人canstatincD

2、NA的重組質(zhì)粒pSecTag2B/canstatin。將該重組質(zhì)粒瞬時轉染中國倉鼠卵巢(CHO-K1)細胞72h后，分別離心收集細胞和上清液，應用RT-PCR檢測細胞中canstatin基因的表達，SDS-PAGE電泳檢測轉染后細胞和上清液中重組融合蛋白的表達，并用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗初步鑒定其生物學活性。結果:成功獲得684bp人canstatin基因，測序證明canstatincDNA編碼序列與Genbank中報道的序列一致

3、。成功構建人canstatincDNA分泌型真核表達載體pSecTag2B/canstatin，將此重組質(zhì)粒瞬時轉染CHO-K1細胞，RT-PCR證實質(zhì)粒pSecTag2B/canstatin已成功轉染進入CHO-K1細胞。離心收集轉染72h后的細胞和細胞上清液，在SDS-PAGE凝膠上均顯示出一條約30kD的融合蛋白條帶，與推測的蛋白大小相近，且細胞上清液中此蛋白條帶較細胞內(nèi)更明顯。該細胞上清液在體內(nèi)能抑制雞胚絨毛尿囊膜中微血管的生成

4、，實驗組雞胚絨毛尿囊膜顏色蒼白，微血管生長減慢，數(shù)目稀少，血管輪廓模糊不清；對照組雞胚絨毛尿囊膜顏色紅潤，微血管生長活躍，數(shù)目明顯增多，血管輪廓清晰可見。結論:1、成功構建了重組克隆載體pUCm-T/canstatin和分泌型真核表達載體pSecTag2B/canstatin。2、陽離子脂質(zhì)體介導重組分泌型真核表達質(zhì)粒pSecTag2B/canstatin轉染進入CHO-K1細胞，人canstatin基因在mRNA水平獲得瞬時表達，該C