1、卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)肉質鮮美，生長速度快，可攝食人工配合飼料，是我國熱帶、亞熱帶海域重要的網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類之一。然而近年來由于病害頻發(fā)，給卵形鯧鲹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失。因此，研究卵形鯧鲹免疫基因與抗病性狀關聯(lián)性，確定免疫分子標記，建立免疫防控技術，對支撐卵形鯧鲹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。本研究從實驗室前期測序獲得的卵形鯧鲹基因組和轉錄組數(shù)據(jù)庫中獲取了主要組織相容性復合體Ⅱβ(majorhistoco

2、mpatibility complexⅡβ，MHCⅡβ)和γ-干擾素誘導的溶酶體巰基還原酶(interferon-γ-inducible lysosomal thiol reductase，GILT)的部分序列，利用RACE技術克隆獲得MHCⅡβ和GILT基因cDNA全序列，以此為基礎比對基因組數(shù)據(jù)庫，獲得了MHCⅡβ和GILT基因組全序列，分析了其組織表達和細菌感染前后表達譜特征，篩選了基因多態(tài)性位點，分析了基因多態(tài)性與抗菌性狀的相關

3、性，取得的主要結果如下：
　　一、卵形鯧鲹MHCⅡβ表達調控及其基因多態(tài)性與抗菌性狀的關聯(lián)分析
　　結論：ToMHCⅡβcDNA全長為1472 bp，開放閱讀框(ORF)747 bp，編碼248個氨基酸。系統(tǒng)進化樹分析顯示卵形鯧鲹與其他魚類親緣關系較近，與兩棲類和哺乳類的親緣關系較遠。
　　組織表達分析表明MHCⅡβmRNA在卵形鯧鲹13個組織中均有表達，在脾和頭腎中表達量較高，在鰭中表達量最低。感染美人魚發(fā)光桿菌(P

4、hotobacterium damselae)后，卵形鯧鯵 MHCⅡβmRNA在在肝、脾、頭腎、腸四個組織中總體均有上調表達。
　　本研究對核苷酸多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，在278 bp的序列中并未發(fā)現(xiàn)缺失、移碼和插入突變，序列中共發(fā)現(xiàn)了69個核苷酸突變位點，變異率為24.8％，其中存在6個雙核苷酸突變區(qū)，7個三核苷酸突變區(qū)，2個四核苷酸突變區(qū)。整個核苷酸突變的熱點區(qū)域分布于18-50bp之間。實驗發(fā)現(xiàn)278 bp的核苷酸序列翻譯為由72個

5、氨基酸組成的多肽序列，有28個位點是多態(tài)的，變異率為38.29%。通過比對將下列5個氨基酸位點作為PBR位點進行進一步分析，統(tǒng)計分析表明，所有序列在PBRs區(qū)的平均w值為6.60(>1)，證明該區(qū)域的核苷酸多樣性受正向選擇的影響。對獲得的基因在抗感組和易感組中進行頻率分布的統(tǒng)計分析，其中有6個只出現(xiàn)在抗感群體中，有13個只出現(xiàn)在易感群體中，最終，有6個被選做下一步的統(tǒng)計分析中，并對其在兩組中的分布頻率進行顯著性分析。結果顯示，TO-DA

6、B-01在抗感群體中的分布頻率(0.223)要顯著地高于在易感群體中的分布頻率(0.058)(P＜0.01)，而TO-DAB-04，TO-DAB-05，和TO-DAB-10在易感群體中的分布頻率(0.045，0.120，0.063)要顯著地高于在抗病群體中的分布頻率(0.008，0.050，0.020)(P＜0.01)。因此可以初步推斷，TO-DAB-01與卵形鯧鲹對美人魚發(fā)光桿菌的抗感性顯著相關，而TO-DAB-04, TO-DAB-

7、05，和TO-DAB-10與卵形鯧鲹對美人魚發(fā)光桿菌的易感染性具有顯著關聯(lián)性。為探討卵形鯧鲹基因組中存在的MHCⅡβ基因位點數(shù)目，對每個個體的5個陽性克隆序列進行了比對分析，結果表明，單個個體所檢測的單倍型數(shù)目介于2-3之間，暗示在卵形鯧鲹基因組中至少存在2個MHCⅡβ基因位點。
　　二、卵形鯧鲹GILT表達調控及其基因多態(tài)性與抗菌性狀的關聯(lián)分析
　　結論：ToGILT基因全長6837bp,包括7個外顯子，6個內含子，符合G

8、T-AG規(guī)則。包括232 bp的5′UTR，771 bp的ORF和1746 bp的3′UTR。在起始點上游以及906bp存在啟動元件CAAT盒，微衛(wèi)星片段用方框表示。ToGILT基因共編碼256個氨基酸，其理論相對分子量和理論等電點約為28.6kD和5.97。GILT基因cDNA全長2749 bp，功能基序位點有蛋白激酶A(PKA)(77NSG79)、蛋白激酶G(PKG)(77NSG79)，5個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，3個N-豆蔻酰基化

9、位點，胰島素受體 C(INSR)(51EYI53、176EYT178)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)(153TSD155、157TST159)，未發(fā)現(xiàn)糖基化位點，但有四個保守的半胱氨酸殘基。
　　通過檢測ToGILT mRNA在卵形鯧鲹各組織中相對表達量。結果顯示ToGILT mRNA在13個組織中均有表達。其中在肌肉的表達量最低，脾中的表達量最高肝臟和頭腎中的表達量與其他組織的表達量存在顯著差異(P＜0.05)。同樣

10、感染美人魚發(fā)光桿菌后，ToGILT mRNA在肝、脾、頭腎、腸四個組織中總體均有上調表達。肝和腸組織在感染細菌后，表達量開始上調，在24 h的表達量達到最高，然后開始有下降的趨勢；脾和頭腎組織的表達量開始上調，在12h表達量最高，然后開始有下調趨勢，在72 h時基本回復初始表達量。
　　ToGILT基因存在一個SNP位點，其中基因型CG在易感群體中的分布頻率(0.852)分別要顯著地高于在抗感群體中的分布頻率(0.148)(P＜0