1、目的：
　　B細胞活化后、歷經克隆增殖、體細胞高頻突變、抗體類別轉化等過程最終分化成為漿細胞和記憶性B細胞，這些過程都需要CD4+T細胞的輔助?，F(xiàn)在普遍認為，這些輔助B細胞的CD4+T細胞亞群，是一群因高表達CXCR5而在淋巴濾泡逗留的輔助T細胞，即淋巴濾泡輔助T細胞(Follicular Helper T cells，TFH)。TFH細胞的失調與多種疾病的發(fā)生相關，包括自身免疫性疾病、免疫缺陷、感染性疾病、腫瘤等。因此，研究TF

2、H細胞的分化和功能，將為疫苗和佐劑的設計、疫苗使用的優(yōu)化以及治療TFH細胞失調引起的各種疾病提供更好的方向、靶點和策略，具有重要的科學意義和實用價值。
　　在LCMV病毒急性感染模型中，CD4+T細胞分化成為TFH細胞和TH1細胞，并分別發(fā)揮了輔助B細胞和CD8+T細胞的作用?；罨腃D4+T細胞是如何分化成為這兩種表型、功能完全不同的細胞亞群，是獲得性免疫領域研究的重點。TFH細胞分化是一個多因素、多階段的復雜過程。在一些關鍵分

3、子的調控下，CD4+T細胞開啟完全不同的基因表達模式，使得細胞向著不同的分化終點前進。其中，轉錄因子Bcl-6及Blimp1被認為是決定CD4+T細胞命運的關鍵分子。
　　Bcl-6是TFH細胞分化過程中的關鍵轉錄因子，而Blimp1是與Bcl-6相互拮抗的分子。它們之間的平衡決定了CD4+T細胞的分化。高表達Bcl-6的細胞最終分化為TFH細胞，而Blimp1可以促進細胞往non-TFH細胞方向分化。Bcl-6受到多種因素的調控

4、。IL-6-STAT1， IL-12-STAT4和IL-21-STAT3通路都被報道能夠誘導Bcl-6的表達;Batf也被認為是能夠促進Bcl-6表達的上游轉錄因子。同時，Bcl-6能夠受到Blimp1的負調控。
　　而本課題的研究對象TCF-1（由Tcf7基因編碼），是一個在T細胞的發(fā)育、分化、功能以及記憶過程中都具有重要作用的轉錄因子。在T細胞發(fā)育過程中，TCF-1在發(fā)育的不同階段具有顯著不同的功能，受到Notch信號及WNT

5、信號通路的調控。而在成熟的CD8+T細胞中，TCF-1影響活化CD8+T細胞分化命運，同時對于記憶細胞的分化及維持均具有重要意義。在CD4+T細胞中，已經證實TCF-1參與了TH1/TH2/TH17細胞的分化過程，是一個作用廣泛的調控分子。有報道稱TCF-1在TFH細胞中高表達而在TH1細胞中表達水平顯著下降，暗示我們TCF-1在TFH細胞中應當具有重要的作用。
　　我們于是和本教研室葉麗林教授課題組共同開展了TCF-1在TFH細

6、胞中的功能研究。我們利用TCF-1條件敲除小鼠、shRNA沉默系統(tǒng)、過表達系統(tǒng)以及TCF-1誘導敲除小鼠，在LCMV感染模型中，進行了一系列的表型研究。我們發(fā)現(xiàn):感染后，TFH細胞高表達TCF-1、而TH1細胞中TCF-1表達水平很低，這種差異從感染后第2天持續(xù)到第8天。條件敲除或者shRNA沉默Tcf7，都能造成TFH細胞頻率、數(shù)量、功能的缺陷，并最終影響B(tài)細胞分化及抗體水平。誘導敲除實驗證實，TCF-1主要是在早期影響TFH細胞的分

7、化;而對于成熟TFH細胞， TCF-1影響了TFH細胞對B細胞的輔助能力。
　　雖然我們已經證實了TCF-1對于TFH細胞分化及功能的重要性，但是TCF-1調控該過程的分子機制還并不清楚。在本研究課題中，我們通過Microarray、ChIP-PCR、CoIP等多種實驗手段，篩選TCF-1調控調控TFH細胞分化及功能的下游靶基因，并揭示調控的詳細機制。
　　方法和結果：
　　1.篩選TCF-1調控TFH細胞分化及功能的

8、靶基因
　　我們分選了來自野生型以及Tcf7敲除小鼠感染后第8天的TFH細胞和TH1細胞。提取RNA，進行Microarray檢測。Microarray數(shù)據(jù)顯示:相比于正常TFH細胞，TCF-1缺失的TFH細胞中有569個基因表達下降，同時有513個基因表達上升。我們將這些變化的基因，與已發(fā)表文獻中證實的TFH細胞分化相關基因進行GSEA分析。發(fā)現(xiàn)文獻報道與促進TFH細胞分化相關的基因，在我們的正常TFH細胞樣本組均高表達，而文獻

9、中與TH1細胞分化相關的基因，則在TKO來源的TFH細胞中表達上調。這說明，TCF-1的缺失，使得TFH細胞部分失去其應有的細胞表型，表現(xiàn)出TH1細胞的特征。這些被TCF-1調控與TFH細胞分化功能相關的基因包括Icos，Cxcr5,Ascl2,Il21，Il6st等，其中我們發(fā)現(xiàn)，TFH細胞分化的關鍵轉錄因子Bcl-6以及嚴重抑制TFH細胞分化的Blimp1，它們的基因表達也受到TCF-1影響。
　　2.TCF-1直接調控Bcl

10、-6-Blimp1軸
　　分別構建了包含這兩個調控元件的雙熒光素酶報告基因質粒以及突變TCF-1保守結合位點的突變體。在293T細胞中轉染質粒，雙熒光素酶報告基因檢測。結果顯示，TCF-1保守結合位點被突變后，Bcl6 promoter相對熒光活性降低，而Prdm1regulator則表現(xiàn)出更高的相對熒光活性，反映出TCF-1通過直接結合到這些轉錄元件的保守結合位點，促進Bcl6啟動子區(qū)域的轉錄活性、同時抑制Prdm1調控子區(qū)域的

11、轉錄。接下來，我們在體內證實了這個結論，體內報告基因檢測結果與體外基本一致，在TFH細胞中，TCF-1的調控作用更加明顯。因此，我們認為TCF-1直接結合到Bcl6啟動子促進其表達;結合到Prdm1調控子發(fā)揮抑制作用。TCF-1直接轉錄調控Bcl-6-Blimp1軸，它通過調節(jié)Bcl-6-Blimp1軸的平衡來決定CD4+T細胞分化命運。
　　3.TCF-1與Bcl-6相互作用影響TFH細胞功能
　　我們克隆了帶有標簽的Bc

12、l-6、TCF-1 P33、P45亞型。將Bcl-6與TCF-1的不同亞型共轉293T細胞，CoIP實驗結果顯示Bcl-6與P33、P45具有直接的相互作用。在內源CoIP中，我們在感染后第8天活化的CD4+T細胞中，用Bcl-6的抗體進行CoIP。在檢測到Bcl-6明顯富集的同時，也發(fā)現(xiàn)TCF-1 P33、P45亞型也出現(xiàn)在Pulldown產物里，進一步證實了Bcl-6-P33/P45相互作用。
　　共轉Bcl-6、P45、B-

13、catenin，結果顯示B-catenin阻斷Bcl-6與P45的結合。對于TFH細胞的分化來講，B-catenin與P45的結合具有重要意義。導入ICAT質粒的SMARTA細胞，TFH細胞頻率降低，這是因為ICAT干擾了β-catenin與P45的結合，導致P45不能完全發(fā)揮其轉錄功能。
　　共轉Bcl-6、P33、Tle3，結果顯示Tle3能夠增強P33-Bcl-6相互作用。P33與Bcl-6的相互作用能夠影響B(tài)cl-6的轉錄

14、活性。我們使用了能夠被Bcl-6直接結合而不被TCF-1調控的突變Bcl6啟動子區(qū)域進行報告基因檢測，當P33與Bcl-6同時存在的情況下，導入該啟動子區(qū)域的CD4+T細胞表達更高的Thy1.1。
　　最后，我們在SMARTA細胞中共轉質粒，在沉默Tcf7的同時過表達Bcl6，沉默Tcf7造成的TFH細胞缺陷能夠完全被過表達Bcl6挽救。進一步證實TCF-1是Bcl-6-Blimp1軸上游轉錄調控因子。
　　結論：
　

15、　結合表型研究中的發(fā)現(xiàn)以及我們在機制研究中的重要結果。我們證實TCF-1是影響TFH細胞分化及功能的重要轉錄因子。在TFH細胞分化早期，TCF-1通過直接的轉錄調控，作用于Bcl-6-Blimp1軸，促進Bcl-6并抑制Blimp1表達，推動細胞向TFH細胞方向分化;在成熟的TFH細胞中，TCF-1 P33亞型能夠與Bcl-6直接相互作用，影響B(tài)cl-6的轉錄功能，從而影響TFH細胞輔助B細胞的功能。TCF-1從多種角度發(fā)揮作用，調節(jié)T