1、胃癌是世界范圍內(nèi)第二大常見(jiàn)的癌癥，每年新增病例約90萬(wàn)。盡管過(guò)去的幾十年中，胃癌的發(fā)病率和死亡率在全球大部分地區(qū)已顯著下降，但是晚期胃癌病情的控制仍十分困難。
　　赫賽汀(Herceptin)是靶向人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)的治療性單克隆抗體，現(xiàn)為HER2陽(yáng)性乳腺癌標(biāo)準(zhǔn)化治療的一線用藥。對(duì)于HER2陽(yáng)性的晚期胃癌患者，赫賽汀與化療聯(lián)用亦有效。根據(jù)國(guó)際Ⅲ期赫賽汀臨床試驗(yàn)結(jié)果，胃癌患者的反應(yīng)率、中位無(wú)進(jìn)展生存期、中位總生存期均

2、顯示臨床和統(tǒng)計(jì)學(xué)獲益。目前，赫賽汀已被批準(zhǔn)用于HER2陽(yáng)性晚期胃癌患者的臨床治療。
　　然而，赫賽汀耐藥是乳腺癌和胃癌治療中普遍存在的問(wèn)題。HER2陽(yáng)性胃癌患者約占25％，而患者對(duì)赫賽汀的反應(yīng)率僅為12.8％，遠(yuǎn)低于在乳腺癌中的報(bào)道。已知的赫賽汀耐藥機(jī)制主要來(lái)自乳腺癌研究的發(fā)現(xiàn)，包括PI3K信號(hào)通路過(guò)度活化、PTEN（磷酸酶和張力酶同源物）缺失、PI3K的催化亞基PIK3CA突變。然而，有關(guān)胃癌的赫賽汀原發(fā)性和獲得性耐藥機(jī)制鮮有報(bào)

3、道。
　　本研究中，通過(guò)對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)行梯度加壓誘導(dǎo)，建立了赫賽汀耐藥的胃癌細(xì)胞株NCI-N87-R和MKN-45-R。細(xì)胞增殖活性分析結(jié)果表明，NCI-N87-R和MKN-45-R細(xì)胞已獲得顯著的赫賽汀抗性。光學(xué)顯微鏡下可觀察到，耐藥細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，Western blot和免疫熒光標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞中上皮標(biāo)志性蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白-1(ZO-1)的表達(dá)明顯下調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志性蛋白波

4、形蛋白(Vimentin)的表達(dá)則明顯升高，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)的重要調(diào)控分子ZEB1、Slug、Snail的表達(dá)亦上調(diào)，提示耐藥細(xì)胞發(fā)生了EMT。進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、三維培養(yǎng)、失巢凋亡、軟瓊脂集落形成、裸鼠體內(nèi)成瘤等實(shí)驗(yàn)，證實(shí)耐藥胃癌細(xì)胞的遷移能力、侵襲性、轉(zhuǎn)移能力和致瘤原性均顯著增強(qiáng)，表明赫賽汀長(zhǎng)期處理導(dǎo)致胃癌細(xì)胞產(chǎn)生了藥物抗性及獲得了惡性表型。

5、>　　EMT可賦予腫瘤干細(xì)胞（Cancer Stem Cell，CSC）的特性，如自我更新、分化、對(duì)放化療耐藥等。有研究表明，CD44+的胃癌細(xì)胞具有CSC樣特征。對(duì)NCI-N87-R細(xì)胞進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量RT-PCR和流式細(xì)胞分析，發(fā)現(xiàn)NCI-N87-R細(xì)胞中CD44蛋白和mRNA水平均顯著升高。細(xì)胞微球形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NCI-N87-R細(xì)胞的自我更新能力顯著增強(qiáng)。此外，NCI-N87-R細(xì)胞中其它干細(xì)胞相關(guān)蛋白（CD133和OCT4）

6、的表達(dá)亦明顯升高。在MKN-45-R細(xì)胞中獲得了相同的結(jié)果。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，NCI-N87-R細(xì)胞的致瘤原性顯著增強(qiáng)，接種5×103個(gè)即可在動(dòng)物體內(nèi)成瘤，提示赫賽汀耐藥的胃癌細(xì)胞已獲得了CSC樣表型。
　　為了闡明胃癌細(xì)胞赫賽汀耐藥的分子機(jī)制，檢測(cè)了赫賽汀耐藥的胃癌細(xì)胞中HER2介導(dǎo)的幾個(gè)重要生存信號(hào)通路(AKT、ERK和STAT3)的活化。在母本細(xì)胞中，HER2下游的ERK及AKT呈明顯活化，而STAT3的磷酸化水平較低。

7、然而，在NCI-N87-R細(xì)胞中，AKT的活化幾乎被完全抑制，而STAT3呈異?；罨?。雙熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示，NCI-N87-R細(xì)胞中STAT3的活性明顯增強(qiáng)。應(yīng)用WP1066阻斷Jak2/STAT3信號(hào)，可顯著抑制耐藥細(xì)胞的增殖，并恢復(fù)耐藥細(xì)胞對(duì)赫賽汀的敏感性。這些研究結(jié)果提示，母本細(xì)胞賴以生存的信號(hào)在耐藥過(guò)程中發(fā)生了明顯偏轉(zhuǎn)，STAT3信號(hào)異常活化在胃癌細(xì)胞赫賽汀耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。
　　STAT3信號(hào)通路活化與多種

8、腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6等可直接或間接激活STAT3信號(hào)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT和CSC轉(zhuǎn)化。通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR和ELISA分析，發(fā)現(xiàn)NCI-N87-R細(xì)胞中IL-6 mRNA的表達(dá)水平增加了上百倍。在母本細(xì)胞中，IL-6的分泌在檢測(cè)限以下，而在耐藥細(xì)胞中，IL-6的分泌則高達(dá)7000 pg/mL。IL-6刺激可誘導(dǎo)NCI-N87和NCI-Ng7-R細(xì)胞中STAT3磷酸化，

9、并可明顯拮抗赫賽汀對(duì)NCI-N87細(xì)胞的增殖抑制作用;抑制STAT3信號(hào)可增強(qiáng)NCI-N87-R細(xì)胞對(duì)赫賽汀的敏感性，促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡，提示IL-6大量分泌導(dǎo)致STAT3持續(xù)活化可能是胃癌細(xì)胞對(duì)赫賽汀產(chǎn)生抗性的重要原因。
　　近年來(lái)，Notch信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性逐漸被研究者所認(rèn)識(shí)。在乳腺癌細(xì)胞中，IL-6是Notch信號(hào)通路的靶基因，而Notch活化可促進(jìn)IL-6表達(dá)。為了探索導(dǎo)致赫賽汀耐藥細(xì)胞中IL-6表達(dá)上調(diào)的原

10、因，觀察了Notch信號(hào)在赫賽汀耐藥的胃癌細(xì)胞中是否發(fā)生了變化。實(shí)時(shí)定量RT-PCR及啟動(dòng)子活性分析結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞中Notch蛋白的表達(dá)及轉(zhuǎn)錄激活活性均明顯增強(qiáng)。應(yīng)用γ分泌酶抑制劑抑制Notch胞內(nèi)信號(hào)活化可顯著降低IL-6 mRNA的表達(dá)，表明耐藥細(xì)胞中IL-6過(guò)表達(dá)與Notch活化有關(guān)。Western blot分析結(jié)果表明，IL-6刺激可上調(diào)NCI-N87細(xì)胞中Notch配體Jagged-1表達(dá)，而STAT3抑制劑則可阻斷這一效

11、應(yīng)，提示在NCI-N87細(xì)胞中存在IL-6/STAT3/Jagged-1信號(hào)軸。還發(fā)現(xiàn)，在NCI-N87細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Jagged-1可上調(diào)IL-6及Notch的靶基因HEY1、HEY2表達(dá)，證實(shí)胃癌細(xì)胞中IL-6是Notch下游的靶基因， Jagged-1、Notch、IL-6在耐藥的胃癌細(xì)胞中構(gòu)成正反饋環(huán)路，抑制Notch信號(hào)可增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)赫賽汀的敏感性。此外，在細(xì)胞三維培養(yǎng)和微球形成實(shí)驗(yàn)中，同時(shí)阻斷STAT3和Notch信號(hào)可顯著

12、抑制耐藥細(xì)胞的侵襲表型及CSC樣特性。以上結(jié)果證實(shí)，IL-6/STAT3/Jagged-1/Notch正反饋信號(hào)通路在胃癌細(xì)胞赫賽汀耐藥過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。
　　綜上所述，研究結(jié)果揭示:(1)赫賽汀長(zhǎng)期處理可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞產(chǎn)生抗性。(2) IL-6/STAT3/Jagged-1/Notch信號(hào)軸活化可能是胃癌獲得性赫賽汀耐藥的一個(gè)重要機(jī)制。(3)聯(lián)合阻斷STAT3和Notch信號(hào)可能成為預(yù)防或延緩赫賽汀耐藥的有效策略。本研究為提高