1、背景與目的:
　　眾周所知，肺癌是中國乃至世界的頭號癌癥殺手，且發(fā)病率持續(xù)增加，雖然根據(jù)肺癌的病理特征分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌兩類，但據(jù)流行病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌（non small-cell lung cancer，NSCLC）占80％～85％。約70％-80％的患者在確診時已屬中晚期，因此，對大部分肺癌患者而言，非手術(shù)治療方式具有重要的作用。目前細(xì)胞毒藥物化療對此類人群是有效的治療選擇，但患者總生存期(overall s

2、urvival，OS)也僅有12個月左右，患者3年及5年生存率分別僅為19％和11％。目前針對晚期非小細(xì)胞肺癌的治療以放化療和靶向治療為主，但各方案的有效率僅在20％～30％。而可逆性抑制表皮生長因子受體(EGFR)的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)靶向治療藥物，在用藥10個月左右后會出現(xiàn)耐藥甚至病情惡化。而對所有ErbB受體家族進(jìn)行不可逆地抑制的第二代TKI藥物阿法替尼(afatinib)，雖然對癌細(xì)胞生長的阻斷更全面、更持久，但也不可避免

3、的產(chǎn)生耐藥，加上沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，如何開發(fā)出更經(jīng)濟(jì)有效的治療模式是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究急需解決的問題之一。
　　利尿酸(Ethacrynic acid，EA)是一種親電子髓袢利尿劑，是第一個被用作抗腫瘤藥物研究的谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶S(Glutathion S-transferases，GSTs)抑制劑，可直接作用于GSTs的底物以阻斷其發(fā)揮作用，或與谷胱甘肽(Glutathione，GSH)硫醇基發(fā)生Michael加成反應(yīng)以清除體內(nèi)GSH，從而

4、抑制GSTs活性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的敏感性。近年研究發(fā)現(xiàn)EA及其衍生物除了具有利尿作用外，高濃度條件下還可作為GST和WNT的抑制劑，在乳腺癌中發(fā)揮一定的抗腫瘤作用。近期研究還發(fā)現(xiàn)降低GSH在體內(nèi)的合成可以逆轉(zhuǎn)不可逆TKI afatinib的耐藥治療。而關(guān)于afatinib聯(lián)合EA在肺癌中的用藥研究至今尚未見報道，因此我們擬進(jìn)行afatinib聯(lián)合EA治療突變型非小細(xì)胞肺癌的研究，一方面分析其聯(lián)合用藥效果，另一方面探討其可能的功能機(jī)制，為臨

5、床治療過程中非小細(xì)胞肺癌的聯(lián)合用藥提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。
　　材料與方法:
　　體外實(shí)驗(yàn):對人NSCLC原發(fā)性耐藥細(xì)胞株A549和繼發(fā)性耐藥細(xì)胞株H1975應(yīng)用EGFR-TKI afatinib和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抑制劑EA單用和聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行研究。應(yīng)用CCK8法檢測afatinib和EA單藥對細(xì)胞的殺傷作用，計算各單藥的IC50，同時檢測聯(lián)合用藥的協(xié)同效應(yīng);應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測afatinib和EA單藥和聯(lián)合用藥對A549、H1

6、975細(xì)胞的周期、凋亡的影響;應(yīng)用Transwell法檢測單藥和聯(lián)合用藥后A549、H1975細(xì)胞的侵襲、遷移能力的變化;以繼發(fā)性耐藥的H1975為研究對象，Blank組、afatinib組、EA組及聯(lián)合用藥組作用24h后，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序并分析，通過對基因的表達(dá)差異分析，篩選出發(fā)揮作用的基因，利用RT-PCR檢測篩選出的基因的相對表達(dá)量。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):將接種了A549、H1975移植瘤的裸鼠模型隨機(jī)分為兩組，即A549組、H1

7、975組，每組再隨機(jī)分為4組，(1)Blank組:PBS組;(2) afatinib組:afatinib25mg/kg/d;(3)EA組:EA20mg/kg/d;(4) afatinib+EA組:afatinib25mg/kg/d+EA20mg/kg/d，灌胃給藥，每7天一個周期，共三個周期，每周兩次測量腫瘤體積大小，繪制腫瘤的生長曲線，21天后取瘤稱取裸鼠體重，了解聯(lián)合用藥治療對裸鼠移植瘤的抑制作用。
　　結(jié)果:
　　1.

8、1.Afatinib、EA對A549、H1975細(xì)胞的殺傷作用
　　分別用afatinib、EA單藥和聯(lián)合用藥處理A549、H1975細(xì)胞48h后，觀察到單藥組及聯(lián)合用藥組具有不同的殺傷細(xì)胞的效果。隨著藥物濃度的遞增，各處理組殺傷細(xì)胞的效果逐漸增強(qiáng)，其中，聯(lián)合用藥組明顯強(qiáng)于各單藥組，協(xié)同增效作用明顯。One-wayANOVA檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組對細(xì)胞的殺傷效應(yīng)優(yōu)于afatinib單藥組，并呈現(xiàn)劑量依賴的抗增殖效應(yīng)，差異有統(tǒng)

9、計學(xué)意義(p＜0.05)。采用BioCalcusyn軟件計算聯(lián)合用藥的CI值，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增高，殺傷效果逐漸增強(qiáng)，尤其對于繼發(fā)性耐藥的H1975細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的協(xié)同效應(yīng)(CI＜0.3)。
　　1.2.Afatinib聯(lián)合EA能抑制A549、H1975細(xì)胞的體外、體內(nèi)增殖
　　采用CCK8法檢測相同濃度條件下對A549、H1975細(xì)胞殺傷的影響。結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組處理后的細(xì)胞殺傷率均明顯高于同濃度下afatinib組、E

10、A組，對H1975殺傷的影響較A549尤為明顯。
　　通過測量各組裸鼠移植瘤體積，單藥組、聯(lián)合用藥組平均瘤體積均低于Blank組。A549組中Blank組、afatinib組、EA組、聯(lián)合用藥組腫瘤平均體積分別為1554.7±340.22mm3、604.6±87.80mm3、1093.5±144.53mm3、402.8±89.61mm3; H1975組中Blank組、afatinib組、EA組、聯(lián)合用藥組腫瘤平均體積分別為870.

11、7±126.23mm3、484.1±76.65mm3、723.3±135.72mm3、82.9±24.71mm3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組瘤體積明顯小于Blank組及各單藥組，與afatinib組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05)。
　　A549組中Blank組、afatinib組、EA組、聯(lián)合用藥組抑瘤率分別為0％、51.75±9.17％、29.25±10.37％、69.76±4.25％(F=18.345，p＜0.05);H19

12、75組中Blank組、afatinib組、EA組、聯(lián)合用藥組抑瘤率分別為0％、48.72±10.02％、23.54±12.76％、84.12±8.27％(F=50.192,p＜0.05)。其中，聯(lián)合用藥組抑瘤率最高，說明聯(lián)合用藥對抑制移植瘤的生長具有協(xié)同作用，與細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。
　　1.3.Afatinib聯(lián)合EA對A549、H1975細(xì)胞周期、凋亡的影響
　　CCK8法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組較各單藥組能夠明顯協(xié)同抑

13、制腫瘤細(xì)胞的增殖，這種對腫瘤細(xì)胞的影響可能與細(xì)胞周期、凋亡及其機(jī)制有關(guān)，因此我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測單藥和聯(lián)合用藥對腫瘤細(xì)胞周期、凋亡的影響。細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示:對于A549細(xì)胞，聯(lián)合用藥組與Blank組、各單藥組比較，G0/G1期細(xì)胞的比例明顯增加（p＜0.05);對于H1975細(xì)胞，聯(lián)合用藥組S+G2期細(xì)胞的比例明顯增加（p＜0.05)。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示:單藥組處理A549、H1975細(xì)胞48h后均可促使其凋亡，凋亡率分別為2.

14、5％、2.9％、11.3％、4.7％。聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡均有所增加，分別為5.7％、41.8％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05)，提示afatinib聯(lián)合EA可顯著協(xié)同誘導(dǎo)H1975細(xì)胞的凋亡。
　　1.4.Afatinib聯(lián)合EA對A549、H1975細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響
　　Transwell法實(shí)驗(yàn)觀察對A549、H1975細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。結(jié)果顯示:各單藥組、聯(lián)合用藥組穿過濾膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)較Blank組

15、均減少，聯(lián)合用藥組較各單藥組穿過濾膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)均減少，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05);在侵襲實(shí)驗(yàn)中，A549細(xì)胞afatinib組、H1975細(xì)胞各單藥組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞分解細(xì)胞外基質(zhì)穿過濾膜進(jìn)入下室細(xì)胞減少，聯(lián)合用藥組較各單藥組進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)均減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05);而A549細(xì)胞EA組較Blank組進(jìn)入下室細(xì)胞數(shù)未見明顯減少，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05)。
　　1.5.Afatinib聯(lián)合E

16、A對H1975細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測及機(jī)制研究
　　轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Transcriptomics)是一門研究細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄情況和轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科，通過在RNA水平上對基因的表達(dá)進(jìn)行研究。轉(zhuǎn)錄組測序(RNAsequencing)對基因功能和基因結(jié)構(gòu)整體水平的研究，可以揭示藥物靶點(diǎn)生物學(xué)過程。本研究中以繼發(fā)性耐藥的H1975細(xì)胞為對象，Blank組、各單藥組及聯(lián)合用藥組作用24h后，提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，通過對文獻(xiàn)的參考及對轉(zhuǎn)錄組測序中基因

17、表達(dá)差異分析，我們找出EGFR、P53、TNFSF14、VEGFA、WNT5A、WNT10A、MAPKAP1及MAPK8IP3等相關(guān)基因，利用RT-PCR檢測篩選出的基因的相對表達(dá)量，結(jié)果與測序結(jié)果基本一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果是可靠的。通過對差異表達(dá)的基因分析我們找出發(fā)現(xiàn)主要與20條信號通路相關(guān)，其中，與癌癥最密切的是Pathway in cancer、Wnt signalingpathway和cytokine-cytokine rec

18、eptor interaction這三條信號通路。根據(jù)基因表達(dá)差異數(shù)據(jù)分析我們發(fā)現(xiàn)了155個上調(diào)和175個下調(diào)的基因。（篩選條件:FDR＜0.01，Log Fold-change≥2和≤-2，Pvalue＜0.001）。為后續(xù)進(jìn)一步研究聯(lián)合用藥對抗繼發(fā)性耐藥NSCLC的分子機(jī)制提供重要的數(shù)據(jù)資源。
　　結(jié)論:
　　1.Afatinib或EA單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用均對A549、H1975細(xì)胞具有殺傷作用;聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞在較大劑

19、量(afatinibIC50+EAIC50)時有協(xié)同殺傷效應(yīng);對H1975細(xì)胞具有強(qiáng)烈的協(xié)同殺傷作用，CI＜0.3。
　　2.Afatinib聯(lián)合EA可在體外、體內(nèi)殺傷耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、H1975，尤其對繼發(fā)性耐藥的肺癌細(xì)胞H1975殺傷效果尤為明顯。
　　3.Afatinib和/或EA對A549、H1975細(xì)胞周期具有阻滯作用，對細(xì)胞凋亡具有協(xié)同促進(jìn)作用;對A549、H1975細(xì)胞的遷移、侵襲能力具有抑制作用。

20、
　　4.Afatinib聯(lián)合EA與afatinib單藥對人肺癌細(xì)胞H1975的基因表達(dá)差異，上調(diào)基因有FGFR2、TNFRSF4、WNT6、FZD6、CCR1、IL1R2等，下調(diào)基因有CBLC、SMO、IL12B、CXCL14、CX3CR1、NGFR等;可能通過Pathway in cancer、 Wnt signaling pathway和cytokine-cytokine receptorinteraction這三條信號通路