1、目的：
　　骨組織工程技術是骨缺損結構及功能性修復的關鍵，為重建骨缺損部位的功能結構，實現(xiàn)骨組織工程支架結構和力學環(huán)境與正常骨組織的仿生，本課題組以絲素蛋白、膠原蛋白和納米羥基磷灰石作為原料，采用低溫三維打印技術和真空冷凍干燥技術制備仿生復合骨組織工程支架，并以小鼠成骨細胞系MC3T3-E1作為種子細胞定向構建功能性骨單元，從而為骨缺損的治療提供一定的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.骨組織工程支架原料的提?。杭倚Q絲經(jīng)過

2、堿液煮沸、脫膠、透析及濃縮后提取得到絲素蛋白。新鮮牛肌腱經(jīng)含胃蛋白酶的醋酸溶液處理后通過鹽析法制得膠原蛋白。
　　2.仿生復合骨組織工程支架的制備：將質量比為3:9:2的絲素蛋白、膠原蛋白和納米羥基磷灰石充分攪拌混勻置入24孔板中，-80℃過夜后使用真空冷凍干燥機制備復合材料支架（編號A組）。同時取相同質量比的絲素蛋白、膠原蛋白和納米羥基磷灰石充分攪拌混勻裝入低溫打印機料筒，設置三維打印控制參數(shù)，使用低溫三維打印機和真空冷凍干燥機

3、制備復合材料支架（編號B組）。兩組支架經(jīng)過無水乙醇、NaOH溶液及Co60滅菌處理后備用。
　　3.仿生骨支架理化性能的檢測：采用微計算機斷層掃描技術對A組和B組支架結構進行分析，力學試驗機檢測仿生支架的力學性能。采用 X射線多晶衍射儀、付立葉變換紅外光譜儀以及示差掃描量熱儀分析支架材料的分子結構。
　　4.組織工程化培養(yǎng)模型的建立：取相同密度的MC3T3-E1細胞接種于兩組支架，在37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)4 h后，加

4、入α-MEM完全培養(yǎng)液，A組為對照組，B組為實驗組，每2天換1次等量的培養(yǎng)液。
　　5.仿生骨支架材料的細胞相容性分析：采用MTT和堿性磷酸酶(ALP)法分別檢測兩組支架細胞增殖和分化情況，倒置顯微鏡及掃描電鏡（SEM）觀察每組支架表面和內部細胞生長情況，采用實時定量熒光多聚集鏈反應（ Real-time PCR）及蛋白質印跡法（Western blot）檢測細胞特異性基因表達情況。
　　結果：
　　1.兩組支架形態(tài)穩(wěn)

5、定，B組比A組支架更為規(guī)整，較符合設計的支架模型。
　　2.兩組復合支架材料均為三維多孔結構，具有一定的孔徑、孔隙率及吸水膨脹率：A組支架孔徑為（163.15±61.93）μm，壁厚為（290.42±71.19）μm，孔隙率為（92.21±2.16）%，吸水膨脹率為（724.09±98.05）%；B組支架大孔徑為（506.37±18.63）μm，小孔徑為（62.14±17.35）μm并存，兩者并存，壁厚為（91.63±18.11）

6、μm，孔隙率為（97.70±1.37）%，吸水膨脹率為（1341.97±64.41）%。A、B組的彈性模量分別為（31.91±11.25）kPa和（340.93±71.98）kPa，A組低于B組（P＜0.05）。X衍射圖譜、紅外光譜以及示差掃描量熱圖顯示A組與B組支架原料的特征性峰值相似，表明蛋白分子結構、分子結晶度以及分子間作用力并無明顯改變。
　　3.MTT法和ALP活性檢測結果表明，實驗組細胞的增殖和分化活性高于對照組。倒置

7、顯微鏡及掃描電鏡下可見兩組支架表面有大量細胞粘附生長，充分伸展，而且實驗組大孔壁上細胞粘附生長良好，培養(yǎng)至21天細胞可布滿部分孔隙。支架與細胞共培養(yǎng)21天后，Real-time PCR結果表明實驗組MC3T3-E1細胞COLⅠ、ALP及OCN基因的轉錄水平高于對照組（P＜0.05），Western blot結果表明對照組及實驗組COLⅠ、ALP及OCN蛋白翻譯水平均良好。
　　結論：
　　1.兩組支架形態(tài)規(guī)則，均為三維多孔結

8、構。低溫三維打印制備工藝參數(shù)的“個性化”，使得骨組織工程支架具有可控性的大、小孔徑，可提供更多的細胞粘附面積。B組支架在孔徑大小、孔隙率、吸水膨脹性及力學性能等方面優(yōu)于 A組，有利于細胞養(yǎng)料和代謝產(chǎn)物的運輸。
　　2.低溫三維打印技術及真空冷凍干燥制備工藝均未破壞復合骨支架原材料的分子結構與蛋白活性，支架有機成分與無機成分的生物活性仍保持不變。
　　3. MC3T3-E1細胞系接種兩組支架后均能正常生長增殖，實驗組細胞生長、