1、紅霉素（erythromycin）是一類應(yīng)用于臨床上的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，由糖多孢紅霉菌（Saccharopolyspora erythraea）發(fā)酵產(chǎn)生。它在保障人類健康方面發(fā)揮了重要作用，但令人困惑的是日益嚴(yán)重的耐藥性問題。目前已經(jīng)上市了化學(xué)半合成第三代紅霉素，但是化學(xué)方法有步驟繁瑣、引起環(huán)境污染等缺陷。探索基因工程方法改造紅霉素合成過程，可為新型抗生素的研發(fā)開辟新的途徑。
　　 糖基是許多抗生素母環(huán)合成后添加的基團(tuán)，是其發(fā)揮

2、抑菌生物活性所必不可少的組分，也是影響生產(chǎn)菌自我保護(hù)等功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。通過對(duì)糖基的改造可以合成新的代謝產(chǎn)物，而改變糖基轉(zhuǎn)移酶又是改造糖基的主要途徑之一。在紅霉素合成過程中有兩個(gè)糖基化過程，一個(gè)是大環(huán)C-3位上的糖基化，一個(gè)是C-5位上的糖基化。糖基轉(zhuǎn)移酶EryBⅤ和EryCⅢ分別負(fù)責(zé)這兩個(gè)糖基化反應(yīng)。本文以這兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶為對(duì)象，利用同源重組的方法構(gòu)建兩個(gè)糖多孢紅霉菌突變體，探索改造糖基結(jié)構(gòu)、合成紅霉素衍生物的基因工程新途徑。
　

3、　 為了失活糖基轉(zhuǎn)移酶EryBⅤ和EryCⅢ，本研究采取基因敲除的方法分別缺失它們的編碼基因eryBⅤ、eryCⅢ。為了實(shí)現(xiàn)這一效果，分別設(shè)計(jì)刪除這兩個(gè)基因中130bp堿基得到失活的ΔeryBⅤ、ΔeryCⅢ片段，各在刪除部分前后選擇1000bp左右的片段進(jìn)行擴(kuò)增，形成突變基因的兩個(gè)同源臂，克隆至pUC18質(zhì)粒上構(gòu)建pUC18-ΔeryBⅤ和pUC18-ΔeryCⅢ。鑒定后再將ΔeryBⅤ和ΔeryCⅢ亞克隆至同源重組型質(zhì)粒pWHM3

4、上，分別構(gòu)建同源重組質(zhì)粒pWHM3-ΔeryBⅤ和pWHM3-ΔeryCⅢ。接著將它們分別導(dǎo)入糖多孢紅霉菌A226原生質(zhì)體中，經(jīng)硫鏈絲菌肽抗性篩選出A226/pWHM3-ΔeryBⅤ和A226/pWHM3-ΔeryCⅢ整合體菌株各一株，對(duì)兩者進(jìn)行生物活性試驗(yàn)和薄層層析，顯示質(zhì)粒的整合均破壞了紅霉素合成途徑，紅霉素A無法正常合成，由此鑒定出兩者分別整合到糖多孢紅霉菌紅霉素合成基因位點(diǎn)。然后，根據(jù)pWHM3質(zhì)粒在無抗環(huán)境下的不穩(wěn)定性，通過抗

5、性負(fù)篩的方法進(jìn)行突變體菌株的篩選，挑取大量克隆檢測(cè)后篩出1株缺失EryBⅤ酶活性和1株缺失EryCⅢ酶活性的糖多孢紅霉菌，分別命名為A226-ΔeryBⅤ和A226-ΔeryCⅢ。兩個(gè)突變體的生物活性試驗(yàn)表明在分別缺失糖基轉(zhuǎn)移酶EryBⅤ和EryCⅢ活性的情況下，它們的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)枯草芽孢桿菌都沒有抑制作用；進(jìn)一步的薄層層析結(jié)果顯示A226-ΔeryBⅤ和A226-ΔeryCⅢ都不積累紅霉素A；最后通過質(zhì)譜分析發(fā)酵產(chǎn)物，對(duì)它們分子量大小的

6、測(cè)定以及對(duì)比發(fā)現(xiàn)A226-ΔeryBⅤ積累紅霉內(nèi)酯B（EB），A226-ΔeryCⅢ積累3-L-mycarose-紅霉內(nèi)酯B（MEB）。隨后，將eryBⅤ和eryCⅢ基因分別克隆至表達(dá)質(zhì)粒pZMW上，導(dǎo)入對(duì)應(yīng)的突變體，結(jié)果恢復(fù)了突變菌株合成紅霉素的能力。
　　 本論文成功構(gòu)建了兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶突變體A226-ΔeryBⅤ和A226-ΔeryCⅢ，這為后續(xù)改造糖基結(jié)構(gòu)，合成新的前體或新的紅霉素衍生物鋪平了道路。此外，兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶編