1、cDNA-AFLP(cDNA-amplifiedfragmentlengthpolymorphism，cDNA-AFLP)分子標記技術(shù)是結(jié)合了mRNA差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)(DifferentialdisplayreversetranscriptasePCR，DDRT-PCR)和擴增片段長度多(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)技術(shù)的優(yōu)點而發(fā)展而來的一種檢測cDNA多態(tài)性的方法。該技術(shù)具

2、有無需了解序列信息、靈敏性高、重復性好和操作相對方便等優(yōu)點，可對生物體轉(zhuǎn)錄組進行全面的分析。由于生物體的進化地位和組織結(jié)構(gòu)的差異，適用于不同生物間的具體反應方案存在差別。本研究通過對cDNA-AFLP技術(shù)關(guān)鍵步驟的優(yōu)化和改進，首次建立了適合于鯉魚的cDNA-AFLP技術(shù)反應體系。利用建立的反應體系對設計的標記進行了篩選，獲得了69對多態(tài)性較好的cDNA-AFLP標記紐合，并將它用于鯉魚免疫相關(guān)組織基因差異表達研究，獲得了初步的差異信息。

3、本研究的內(nèi)容和結(jié)果主要包括：
　　 1.鯉魚cDNA-AFLP技術(shù)反應體系的建立
　　 以德國鏡鯉的腦組織為材料，通過對RNA的用量，酶切，連接，預擴增和選擇擴增各個關(guān)鍵步驟的對比實驗，獲得了適合鯉魚的cDNA-AFLP反應體系。結(jié)果表明，采用MseI和BstYI酶切鯉魚cDNA100ng，分別處理2h和3h后，以接頭濃度分別為2pmol/ul和0.2pmol/ul、酶濃度為0.12U/ul的反應體系進行連接；預擴增后以

4、50倍稀釋的產(chǎn)物為模板、BstYI和MseI比例為1:4的引物配比進行選擇擴增可得到穩(wěn)定的擴增結(jié)果。本研究建立的cDNA-AFLP技術(shù)將為鯉魚轉(zhuǎn)錄組研究建立技術(shù)支持和平臺。
　　 2.德國鏡鯉cDNA-AFLP分子標記的篩選
　　 以液氮保存的德國鏡鯉腦組織和脾組織為材料，利用構(gòu)建的cDNA-AFLP技術(shù)反應體系為基礎，對不同的引物標記組合進行篩選，獲得了適合于德國鏡鯉腦和脾組織中的cDNA-AFLP分子標記。通過對12

5、個MseI-NN與8個BstYI-T/C-N組合成的96對引物進行選擇擴增，共獲得了69對擴增條帶數(shù)目在40-56之間的引物組合。篩選出的標記組合為鯉魚的差異表達和轉(zhuǎn)錄研究提供了基礎材料。
　　 3.鯉魚不同免疫相關(guān)組織的基因差異表達的初步分析
　　 以鴨綠江水域高密度網(wǎng)箱養(yǎng)殖的德國鏡鯉為材料，在魚病爆發(fā)期采集染病個體和正常個體的新鮮腦和脾為樣本，采用構(gòu)建的鯉魚反應體系，選取篩選獲得的69對MseI-NN和BstYI-T

6、/C-N標記組合進行不同時期、不同組織之間的基因差異表達研究。初步結(jié)果如下：
　　 (1)腦組織在正常和染病兩種狀態(tài)下的遺傳距離及遺傳相似度分別為0.2434和0.7857，脾組織為0.2437和0.7855。正常和染病狀態(tài)下腦組織表達遺傳分化指數(shù)(coefficientofgenedifferentiation，Gst)為0.2560，脾組織為0.2678。聚類結(jié)果顯示出來自同一狀態(tài)下樣本的遺傳距離更接近，且經(jīng)過聚類后基本能和

7、另一種時期的個體區(qū)分開來。正常和染病組之間的遺傳分析結(jié)果和聚類分析結(jié)果均能反映出正常和染病兩種狀態(tài)下組織內(nèi)基因的表達呈現(xiàn)較明顯的差異。
　　 (2)無論是在正常或者染病狀態(tài)，腦組織的表達總量略高于脾組織。共獲得腦組織差異表達片段45個，脾組織差異表達片段55個。顯著差異中，不僅存在表達豐度上的不同，同時也存在質(zhì)的差別。正常狀態(tài)下，兩種組織表達顯著差異的類型都是以表達量的差異占主導。在染病后，兩種組織在表達量上的變化不明顯，但是表