1、巴氏桿菌病(Pasteurellosis)是由多殺性巴氏桿菌引起的一類傳染病的總稱，見于各種畜禽和人類。牛巴氏桿菌病潛伏期短，傳播速度快，死亡率高，常對畜牧業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。目前，預(yù)防巴氏桿菌病主要用滅活疫苗或弱毒疫苗，這些疫苗起到了一定的積極作用。但是，巴氏桿菌血清型眾多，而傳統(tǒng)疫苗通常只對同型菌株有較好的保護作用，并且弱毒疫苗還可能造成安全隱患。因此，人們希望研究出一種能對異種血清型菌株提供保護且有安全保證的新型疫苗。本實驗室有

2、相關(guān)研究表明，多殺性巴氏桿菌的plpE基因具有較高的保守性;并且，國內(nèi)外均有文獻報道，多殺性巴氏桿菌的PlpE蛋白很可能是一種交叉保護性抗原。因此，本研究針對牛源A型多殺性巴氏桿菌CQ2株plpE基因的克隆表達及DNA疫苗的研究進行了以下工作:
　　 1、CQ2株plpE基因的克隆表達及其免疫學(xué)活性分析
　　 擴增牛源A型多殺性巴氏桿菌CQ2株plpE基因（去除信號肽），將擴增的DNA片段命名為e1。測序發(fā)現(xiàn)e1第385

3、～387位為TAA（終止密碼子），提示CQ2株plpE基因截段表達的可能。以385～387位TAA的存在將e1分為前半段384bp、后半段564bp。擴增后半段基因并將其命名為e2，融合擴增前后兩段基因并將其命名為e3。
　　 構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET30a(+)/e1、pET30a(+)/e2、 pET30a(+)/e3，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，分別表達約24kD、28kD、44kD蛋白，符合plpE基因截段表達時的推導(dǎo)

4、值。將三種蛋白依次命名為E1、E2、E3。經(jīng)Western-blot分析，蛋白E1、E3有免疫學(xué)活性，而蛋白E2不與用CQ2株攻毒獲得的牛陽性血清發(fā)生反應(yīng)。
　　 用蛋白E1、E3的抗血清分別與CQ2全菌蛋白、蛋白E1、E2、E3進行Western-blot反應(yīng)，證實CQ2株plpE基因確為截段表達。
　　 對CQ2株和其他多殺性巴氏桿菌菌株的plpE基因進行相似性分析，發(fā)現(xiàn)除了本實驗室和CQ2株來自同一批病料的CQ1株

5、有截段終止密碼子，本實驗室其他菌株和GenBank發(fā)表的所有多殺性巴氏桿菌都無此現(xiàn)象，說明CQ2株plpE基因的截段表達為特例，不具普適性。
　　 2、PlpE蛋白對小鼠的免疫原性
　　 用蛋白E1、E3免疫小鼠，連續(xù)免疫三次，三免后10d用ELISA法檢測抗體，發(fā)現(xiàn)兩個免疫組的抗體水平都極顯著高于對照組，且兩個免疫組之間無顯著差異。用牛A型巴氏桿菌CQ2、CQ6、B型巴氏桿菌和禽A型巴氏桿菌進行攻毒實驗，結(jié)果表明兩種蛋

6、白都不能保護小鼠抵抗禽巴氏桿菌的攻擊，但對其他三種菌都能提供一定保護，蛋白E1對CQ2、CQ6、B型巴氏桿菌的保護率依次為42.9％、57.1％、28.6％，蛋白E3依次為57.1％、71.4％、14.3％。
　　 3、DNA疫苗的研究
　　 以DNA片段e1、e3為外源基因，以真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)為載體，構(gòu)建DNA疫苗。用DNA疫苗pcDNA3.1(+)/e1、pcDNA3.1(+)/e3免疫小鼠，連續(xù)免

7、疫三次，三免后10d用ELISA法檢測抗體，發(fā)現(xiàn)兩個免疫組的抗體水平都極顯著高于對照組，且pcDNA3.1(+)/e3免疫組抗體水平極顯著高于pcDNA3.1(+)/e1，但兩個DNA疫苗免疫組的抗體水平都極顯著低于兩個蛋白免疫組。用牛A型巴氏桿菌CQ2、CQ6、B型巴氏桿菌和禽A型巴氏桿菌進行攻毒實驗，結(jié)果表明兩種DNA疫苗都不能保護小鼠抵抗牛B型巴氏桿菌和禽巴氏桿菌的攻擊，但能對牛A型巴氏桿菌CQ2和CQ6提供一定保護，pcDNA3

8、.1(+)/e1對CQ2、CQ6的保護率依次為28.6％、57.1％，pcDNA3.1(+)/e3依次為28.6％、42.9％。
　　 從小鼠生存曲線走勢來看，四種疫苗免疫組都比對照組下降更慢，說明四種疫苗對四種菌都有一定的保護作用，由強到弱依次為:蛋白E3＞蛋白E1＞pcDNA3.1(+)/e1＞pcDNA3.1(+)/e3，這與四種疫苗刺激機體產(chǎn)生抗體的能力基本一致，說明蛋白的保護力比DNA疫苗高，且完整蛋白的保護力比截段蛋