1、RESEARCHONTHEROLEOFSRY=BOX2GENESOX2INRATSLIVERI冱GENERArIONADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByZhuQiushiSupervisor：ProfDrXuCu

2、nshuanMay2010摘要性別決定基因家族成員2SOX2是SOX基因家族成員之一，與發(fā)育及細胞的分化與去分化相關。受$0X2在誘導多能性干細胞相關方面研究的啟發(fā)，本文以大鼠再生肝為材料，用液壓轉基因技術(hydrodynamicsbasedtransgene，HDT)，通過基因過表達和RNA干涉的方法，初步研究了SOX2對大鼠肝再生過程的作用，為增加對SOX2在大鼠肝再生中的作用和分子機理的認識提供了資料。本文根據(jù)已發(fā)布的信息對80

3、X2進行了克隆，并從其基因序列上挑選了兩處靶位點設計了兩條干涉RNA片段，將這些經檢測正確的片段分別連接在真核表達載體pEGFPN1和干涉載體pGenesil10上，構建了一條重組表達載體pEGFPN1$0X2及兩條重組干涉載體pGenesil10s199和pGenesil10哂370。而后，雙酶切表達載體pEGFPN1SOX2得到30X2的ORF，將其連接到干涉載體pGenesil10s199和pGenesil1Os370上，構建出干

4、涉載體對應的檢驗載體pGenesil1Os199sox2、pGenesil1Os370sox2。將構建成功的各檢驗載體分別對再生肝模型大鼠進行液壓轉基因，并于轉基因后0、6、12、24、36、48、60、72和84h觀察轉干涉檢驗載體pGenesil1Os199sox2、pGenesil1Os370sox2后的綠色熒光蛋白陽性細胞率(轉染率)與對照檢驗載體pGenesil。10一hksox2相比是否有明顯下降，以此來判斷設計的干涉片段是

5、否對靶位點具有干涉作用。將表達載體和干涉載體分別進行液壓轉基因操作，通過各載體的轉染率找出其在大鼠再生肝組織中表達高峰的時間點，并結合$0X2在大鼠再生肝組織中表達高峰的時間點，得出該基因在大鼠部分肝切除(partialhepatectomyPH)后的最佳轉基因時間。根據(jù)以上結果，利用大鼠肝再生模型和液壓轉基因技術展開了80X2對大鼠肝再生作用的研究。將轉基因后的再生肝材料分別于PH后72、120和168h取出，用熒光顯微技術、統(tǒng)計學方

6、法和常規(guī)組織學技術對大鼠肝臟組織形態(tài)結構、表達動力學和肝指數(shù)等方面的結果進行觀察與分析。經過檢測SOX2克隆成功，其表達載體、干涉載體和檢驗載體構建亦成功。經過對轉干涉檢驗載體pGenesil1Os199sox2、pGenesil1Os370sox2和對照檢驗載體pGenesil1Ohksox2后轉染率的檢測，針對兩處靶位點設計的兩條干涉片段均具有較明顯的干涉作用，其中尤以干涉片段s370的干涉效果最佳。經過對轉表達載體和干涉載體后轉染