1、研究背景及目的：
　　 本研究利用原代培養(yǎng)的大鼠成骨細胞，研究氟對成骨細胞氧化應激，DNA損傷，細胞增殖與凋亡， HO-1和NQO1的基因表達及Nrf2基因表達和其蛋白含量的影響，探討Nrf2-ARE信號轉導通路在氟致成骨細胞損害中的作用。
　　 方 法：
　　 1實驗方法
　　 1.1成骨細胞的培養(yǎng)與鑒定
　　 初生（1～2d）SPF級的SD大鼠購自廣東省廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心。無菌條件下分

2、離大鼠顱蓋骨進行成骨細胞的原代培養(yǎng)，細胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液(含15％FBS，200∪/ml雙抗)，5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)。待細胞達到80％～90％融合時，以1:2進行傳代。培養(yǎng)的細胞經形態(tài)學觀察、NBT/BCIP法染色鑒定，并繪制細胞的生長曲線。
　　 1.2 成骨細胞形態(tài)觀察及細胞增殖測定
　　 將成骨細胞接種于6孔培養(yǎng)板，觀察氟對成骨細胞形態(tài)的影響并攝片；將相同數(shù)量的成骨細胞接種于96孔板，培養(yǎng)24h后，

3、按NaF終濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00mmol/L進行染毒，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h，用MTT法檢測細胞的增殖能力。
　　 1.3細胞周期和凋亡率的檢測
　　 將細胞接種于6孔板培養(yǎng)24h后染氟24h、48h和72h，分別收集12000個細胞，用流式細胞儀在激發(fā)光波長Ex=488nm，發(fā)射光波長Em=530nm下分析PI熒光的直方圖。采用美國PHEONIX公司的MULTYCYCLE軟件進行

4、細胞周期的分析，采用WINMDI軟件進行細胞凋亡率的分析。
　　 1.4 成骨細胞氧化應激水平測定
　　 將細胞接種于24孔板培養(yǎng)24h后染氟24h、48h和72h，收集所得細胞懸液，采用亞硝酸鹽法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用二硫雙硝基苯甲酸（DTNB）法測定谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性、采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法測定脂質過氧化產物丙二醛（MDA）的含量。
　　 1.5 成骨細胞DNA損

5、傷的測定
　　 用單細胞凝膠電泳實驗（SCGE）檢測成骨細胞DNA的拖尾及損傷情況：制備瓊脂載玻片，在熒光顯微鏡下觀察結果并攝片，用SCGE圖像分析系統(tǒng)IMI1.0逐個分析細胞；用酶聯(lián)免疫實驗（ELISA）檢測細胞內DNA氧化損傷產物8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的含量：細胞接種及染毒24h、48h和72h后，收集所得細胞，使用8-羥基脫氧鳥苷檢測試劑盒和酶標儀檢測細胞內8-OHdG的含量。
　　 1.6 RNA提取和

6、RT-PCR實驗
　　 將細胞接種于10cm培養(yǎng)皿，實驗分為：單純染氟組，tBHQ預處理組。用Trizol試劑盒提取成骨細胞的總RNA，用PrimeScriptTM RT-PCR Kit試劑盒檢測單純染氟組和tBHQ預處理組成骨細胞內HO-1mRNA和NQO1mRNA及核轉錄因子Nrf2 mRNA的表達。
　　 1.7免疫蛋白印跡（western blotting）實驗
　　 將細胞接種于10cm培養(yǎng)皿，實驗分為

7、：單純染氟組，tBHQ預處理組。用
　　 NucbusterTM Protein Extraction Kit試劑盒提取核蛋白和漿蛋白，BCA蛋白試劑盒對蛋白含量定量，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，用濕轉法將蛋白轉印至PVDF膜上（250mA，80min）。用5％脫脂牛奶對PVDF膜進行孵育，用一抗Nrf2（1:300）和內參?-actin（1:500），二抗兩者都為1:2000濃度雜交，按照ECL發(fā)光試劑盒操作步驟進行化學發(fā)光反應，

8、并對其進行曝光顯像，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行蛋白灰度值分析，結果用實驗組與對照組的平均灰度值的相對值表示。
　　 2 統(tǒng)計分析
　　 各實驗組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（）表示，采用SAS9.0統(tǒng)計軟件進行分析。滿足正態(tài)性分布且方差齊的兩組之間差異的比較用兩組獨立樣本的t檢驗，多組之間差異的比較用單因素的方差分析，組間兩兩比較用SNK檢驗法，數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性檢驗時用非參數(shù)檢驗，顯著性水平ɑ=0.05，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學

9、意義。
　　 結 果：
　　 1細胞培養(yǎng)與鑒定
　　 剛分離的細胞在倒置顯微鏡下觀察呈微小透亮的圓球形，折光性強，細胞貼壁后主要呈短梭形、細長梭形、三角形及不規(guī)則形。細胞經形態(tài)學觀察和NBT/BCIP法染色鑒定為成骨細胞。
　　
　　 2 氟對成骨細胞形態(tài)及細胞增殖活性的影響
　　 對照組可見細胞已匯合成致密單層，重疊生長、聚集成團的增殖狀態(tài)，低劑量組細胞數(shù)量有所減少，并出現(xiàn)少量空泡的細

10、胞，高劑量組可見細胞數(shù)目明顯減少、細胞間隙增大、空泡增多。隨著染氟濃度的增加和染氟時間的延長，成骨細胞的增殖活性均受到抑制，細胞的存活率呈下降趨勢（P<0.05）。
　　 3 氟對成骨細胞細胞周期和凋亡的影響
　　 氟對成骨細胞周期的影響主要表現(xiàn)為促使G0/G1期細胞增多，S期及G2/M期細胞減少；0.25，0.50，1.00，2.00mmol/L劑量組細胞凋亡不明顯，差異無統(tǒng)計學意義。4.00mmol/L劑量組氟對細胞

11、凋亡的誘導作用顯著，凋亡率明顯升高（P<0.05）。
　　 4 氟對成骨細胞氧化應激指標的影響
　　 染氟24h和48h段，與對照組比較，隨著染氟濃度的增加成骨細胞內主要的抗氧化酶SOD和GSH-Px活性存在下降的趨勢，但72h段，SOD活性先下降后升高；而各時段高劑量組脂質過氧化產物MDA含量則較對照組明顯升高（P<0.05）。
　　 5 氟對成骨細胞DNA損傷的影響
　　 染氟24h，成骨細胞DNA損

12、傷不明顯，染氟48h、72h后，各劑量組的細胞DNA尾長、Olive尾距、尾DNA％及尾/頭長比與對照組相比增加，并隨著濃度的增加而逐漸升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但當4.00mmol/L劑量組時，上述指標較之前劑量有所降低。細胞內DNA氧化損傷產物8-OHdG的含量隨著染氟濃度的增加呈升高的趨勢（P<0.05）。
　　 6 氟對成骨細胞Nrf2 mRNA表達及蛋白含量的影響
　　 單純染氟組：隨著染毒濃度

13、的增加，在24h和48h段NaF能夠持續(xù)誘導成骨細胞內核轉錄因子Nrf2 mRNA的表達，但隨著染毒時間延長至72h，這種誘導作用變的不明顯；細胞染毒24h、48h后NaF能夠持續(xù)使細胞漿中Nrf2蛋白含量下降，而細胞染毒48h后NaF能夠持續(xù)使細胞核中Nrf2蛋白含量升高。
　　 tBHQ預處理組：tBHQ預處理12h后再加氟處理24h、48h和72h，Nrf2 mRNA的表達反較單純染氟組下降，在24h段核蛋白中Nrf2蛋白

14、含量較同組單純染氟組升高。
　　 7 氟對成骨細胞HO-1及NQO1mRNA表達的影響
　　 單純染氟組：單純染氟24h和72h，大鼠成骨細胞內HO-1及NQO1mRNA表達未觀察到明顯變化；單染氟48h，0.25mmol/L組細胞內HO-1及NQO1mRNA表達顯著升高(P<0.05)；0.50、2.00和4.00mmol/L組細胞內HO-1mRNA表達較對照組明顯下降(P<0.05)，而4.00mmol/L組細胞內N

15、QO1mRNA表達顯著升高。
　　 tBHQ預處理組：24h和72h段HO-1mRNA表達較單純染氟組下降；在48h段，4.00mmol/L組能夠誘導HO-1mRNA表達升高；24h 段4.00mmol/L組細胞內NQO1mRNA表達較同組的單純染氟組下降；48h段，0.25 mmol/L組NQO1mRNA表達較同組的單純染氟組下降；72h段，0.50、2.00、4.00mmol/L組NQO1mRNA表達較同組的單純染氟組下降(

16、P<0.05)。
　　 結 論：
　　 1氟能抑制成骨細胞增殖，改變細胞周期，但只有高劑量（4.00mmol/L）時成骨細胞才發(fā)生顯著凋亡。
　　 2 氟可致大鼠成骨細胞發(fā)生脂質過氧化并造成DNA 損傷，同時也能降低細胞內抗氧化酶的活性。
　　 3 氟可誘導大鼠成骨細胞Nrf2基因的表達和蛋白含量的增加，進而使Nrf2-ARE下游靶基因HO-1和NQO1表達增加，使細胞的抗氧化能力增強。
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