1、研究背景:骨骼肌是人體的重要組成部分,占到整個人體總重量的40％左右。它在運動、蛋白質(zhì)儲存和能量代謝中起著重要的作用。為此,任何影響骨骼肌功能的病變都會嚴重影響人體正常機體功能。而骨骼肌萎縮作為骨骼肌病變的一種,常見于臨床上的許多非生理狀態(tài)下,如禁食、癌癥、糖尿病、敗血癥和慢性腎衰等等。不同因為所致肌肉萎縮的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸在肌肉宏觀形態(tài)和功能上表現(xiàn)大同小異,其微觀分子機制研究在近年來取得了豐富成果。哥本哈根大學的研究人員在電鏡下觀察到去神經(jīng)

2、比目魚肌出現(xiàn)細胞皺縮、核固縮、核周池擴大、染色質(zhì)濃縮等細胞凋亡的形態(tài)學改變,但未發(fā)現(xiàn)明顯核碎片。Tews則比較肯定地認為失去神經(jīng)支配后的肌肉存在細胞凋亡現(xiàn)象。他采用末端轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TdT2mediated dU TP nick end labeling,TUNEL)檢測了切斷神經(jīng)的大鼠面肌,發(fā)現(xiàn)失去神經(jīng)支配后大鼠面肌細胞出現(xiàn)DNA碎片?？梢?細胞凋亡可能在骨骼肌萎縮和退化中發(fā)揮極其重要的作用。所以,保護骨骼肌細胞

3、的功能,防止和延緩骨骼肌細胞的凋亡對于對抗骨骼肌的萎縮極其關鍵。顯然抑制骨骼肌細胞的凋亡將是預防和治療肌肉萎縮性疾病的重點之一。以往針對骨骼肌萎縮的治療進行了大量基礎研究和臨床實驗,主要有運動及功能訓練、電刺激、成肌細胞移植、藥物治療包括胰島素樣生長因子-1、重組人生長激素等有一定的療效,但是還沒有一種理想的方法可推廣應用于臨床。因此,探索出一種理想的保護肌肉萎縮的治療策略有著極其重要的意義。我們認為人參皂苷有可能成為有效治療這一疾病的

4、理想藥物。本課題將研究人參皂苷Rg1對無血清培養(yǎng)的C2C12成肌細胞的凋亡保護作用,從而間接的證明人參皂苷Rg1對抗骨骼肌萎縮的作用。
　　 目的
　　 1.探討人參皂苷Rg1對無血清誘導的C2C12成肌細胞凋亡的保護作用。
　　 2.探討人參皂苷Rg1對無血清誘導的C2C12成肌細胞凋亡保護作用的相關信號轉(zhuǎn)導機制。
　　 3.為臨床治療與骨骼肌凋亡相關的疾病提供一個新的探索途徑。
　　 方法

5、r>　　 1.將C2C12成肌細胞接種在25cm2培養(yǎng)瓶中普通傳代培養(yǎng),培養(yǎng)一段時間后將10％的FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液換成無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)C2C12成肌細胞48h后,建立細胞凋亡模型。
　　 2.根據(jù)實驗分組,將10％的FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液換成終濃度為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L人參皂苷Rg1無血清的培養(yǎng)液,培養(yǎng)48h后,利用MTT法檢測細胞活力的變化情況,Hoechs

6、t33258-PI熒光雙染色檢測細胞凋亡率的變化,RT-PCR分析檢測促凋亡基因Caspase-3、AIF、Bax mRNA以及凋亡保護基因Bcl-2 mRNA的表達差異性。
　　 結果
　　 1.MTT結果分析與凋亡組相比較,5、10、20μmol/L人參皂苷Rg1組可以顯著增加細胞活力(P<0.05),其中10μmol/L人參皂苷Rg1組為最佳濃度組,與其他三組都有顯著差異性。
　　 2.Hoechst332

7、58-PI熒光雙染色無血清培養(yǎng)的C2C12成肌細胞培養(yǎng)48h后細胞狀態(tài)明顯不良,而加入5、10、20μmol/L人參皂苷Rg1組中C2C12成肌細胞發(fā)生凋亡比率明顯減少(P<0.05),其中10μmol/L Rg1組效果最顯著,說明人參皂苷Rg1可以減少C2C12成肌細胞凋亡的發(fā)生。
　　 3.半定量RT-PCR分析在基因水平檢測中我們發(fā)現(xiàn),在無血清培養(yǎng)48h的C2C12成肌細胞中,促凋亡基因Caspase-3、AIF、Bax