1、自然流產(chǎn)占全部妊娠的10％～15%,由遺傳、免疫、感染、解剖、內(nèi)分泌、環(huán)境等因素引起,遺傳因素中的染色體異常占所有自然流產(chǎn)的50%～60%。染色體異常分為數(shù)目異常和結構異常,約86%為數(shù)目異常,結構異常僅6%,包括嵌合型在內(nèi)的其它異常占8%。
　　 染色體異?？赡茉从谂渥由汕暗挠薪z分裂、配子生成的減數(shù)分裂或受精卵最初幾次有絲分裂,是自然流產(chǎn)、出生缺陷的主要原因。人體的所有細胞均來源于兩個單倍體配子形成的受精卵,即:配子的染色體

2、異?？蓪е滤械淖哟毎旧w出現(xiàn)異常;卵裂早期部分細胞出現(xiàn)染色體異?？蓪е虑逗闲?而且發(fā)生越早,受影響的子細胞越多。因此,在配子生成、受精和卵裂過程中維持基因組的完整性對于人類胚胎正常發(fā)育至關重要。
　　 單個受精卵發(fā)育成一個由多種細胞、組織和器官組成的個體是通過細胞增殖周期實現(xiàn)的。細胞周期分為G1、S、G2和M期(前、中、后和末期),是在多個檢驗點的嚴格監(jiān)控下、由一系列連續(xù)事件按精確時間順序進行的動態(tài)過程,其中紡錘體組裝檢驗

3、點(spindle assembly checkpoint,SAC)主要作用是監(jiān)控細胞分裂中期所有染色體與紡錘體微管正確連接并排列在細胞赤道面上,細胞方能進入分裂后期,保證染色體能夠精確地分配到子細胞中,防止子細胞染色體出現(xiàn)數(shù)目異常,以維持基因組的完整性。
　　 MAD2、BUB1編碼的蛋白是SAC主要成份。MAD2作用是結合MAD1并被募集到動粒,隨后發(fā)生構象改變,轉變成C-MAD2后,與Cdc20、BUBR1、BUB3形成有

4、絲分裂檢查點復合物(mitotic checkpoint complex,MCC),MCC與后期促進復合物(anaphase promoting complex,APC/C)相互作用并抑制其泛素連接酶活性,使其不能靶向降解securin(人類為hPTTG)和cyclin B,細胞不能進入分裂后期,以提供時間改正不正確的動粒.微管連接,防止染色體分離錯誤。
　　 BUB1是結合BUB3的蛋白激酶,有三個主要區(qū)域:N末端保守區(qū)域作用

5、是定位動粒;非保守區(qū)域作用是結合BUB3;C-末端區(qū)域作用是催化絲氨酸/蘇氨酸激酶。BUB1對于細胞分裂中期染色體中板集合是必須的,具體作用:建立并/或維持有效的紡錘體微管雙極連接;監(jiān)控微管連接到動粒:募集MAD2、BUBR1和著絲粒相關蛋白CENP-E、CENP-F蛋白到動粒;通過Shugoshin保護姐妹染色單體的Cohesion,防止姐妹染色單體過早分離。
　　 近年來,SAC在染色體分離中的作用對于闡明胚胎染色體異常以及

6、在腫瘤生成中的作用成為細胞生物學研究的熱點,但SAC在人類早期胚胎發(fā)育及染色體異常中的作用鮮見報道。本研究采用FISH技術,選用13、16、18、21、22、X、Y染色體特異性探針,檢測自然流產(chǎn)胚胎染色體數(shù)目是否異常,將自然流產(chǎn)胚胎分為染色體數(shù)目正常組和異常組,應用RT-PCR和Western-blot方法檢測自然流產(chǎn)胚胎組織MAD2、BUB1 mRNA及其蛋白的表達,探討其在人類胚胎染色體分離中的作用。
　　 目的：
　

7、　 通過檢測MAD2、BUB1 mRNA及其蛋白在自然流產(chǎn)胚胎染色體數(shù)目正常組、異常組中的表達,探討其在人類胚胎染色體分離中的作用。
　　 材料與方法：
　　 1研究對象
　　 病例來源于鄭州大學第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科2010年6月至2011年1月因先兆流產(chǎn)或超聲發(fā)現(xiàn)胚胎停育而就診的99例自然流產(chǎn)患者,應用FISH技術將其分為染色體數(shù)目異常組和正常組。
　　 2實驗方法
　　 2.1標本采集與處理<

8、br>　　 清宮術后挑取絨毛組織,部分組織按照FISH檢測要求進行標本處理,其余絨毛組織迅速冷凍后置-80℃冰箱用于RT-PCR和Western-blot檢測。該實驗經(jīng)鄭州大學第三附屬醫(yī)院倫理委員會批準,留取標本時,均征求患者同意并簽署知情同意書。
　　 2.2 FISH檢測自然流產(chǎn)胚胎絨毛組織染色體數(shù)目
　　 2.2.1標本處理
　　 無菌挑選自然流產(chǎn)胚胎新鮮絨毛組織5～10mg,生理鹽水沖凈血液和粘液,眼科

9、剪剪碎后低滲,固定,冰醋酸消化,離心后棄上清液,滴片。
　　 2.2.2 FISH檢測
　　 滴好的標本片經(jīng)胃蛋白酶消化后置74.5℃變性液5mn,-20℃預冷乙醇梯度脫水,將10μl探針加于標本片雜交區(qū)域,封片后置濕盒42℃恒溫培養(yǎng)箱中雜交過夜。暗室中將標本片依次置預熱的50%甲酰胺/2×SSC溶液、2×SSC溶液、0.1%NP-40/2×SSC溶液中漂洗,經(jīng)70%乙醇脫水,自然干燥后滴加10μlDAPI復染劑,熒光顯

10、微鏡下觀察結果。
　　 2.3 RT-PCR檢測自然流產(chǎn)胚胎絨毛組織MAD2、BUB1 mRNA的表達
　　 引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。提取胚胎絨毛組織總RNA,將RNA逆轉錄為cDNA,進行RT-PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)15g/L瓊脂糖電泳(溴化乙錠染色)后,采用凝膠成像儀掃描,結果取目的基因與β-actin基因灰度值的比值,作為MAD2、BUB1 mRNA相對表達量。
　　 2.4 Western-b

11、lot檢測自然流產(chǎn)胚胎絨毛組織MAD2,BUB1蛋白的表達
　　 RIPA裂解法提取組織總蛋白,BCA法測定提取的蛋白質總濃度。Western-blot檢測自然流產(chǎn)胚胎絨毛MAD2、BUB1蛋白的表達,以目的蛋白與β-actin蛋白相對灰度比值代表被測基因蛋白相對表達量。
　　 3統(tǒng)計學處理
　　 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理,兩組間孕婦孕周的比較采用校正t檢驗,兩組間孕婦年齡、孕次、自然流產(chǎn)次數(shù)采用

12、Mann-Whitney U檢驗,孕周與胚胎染色體異常率比較采用校正x2檢驗,自然流產(chǎn)次數(shù)與胚胎染色體異常率采用Kruskal Wallis檢驗,計量數(shù)據(jù)以-x±s表示,兩組問MAD2,BUB1表達量比較采用t檢驗,以α=0.05作為檢驗水準。
　　 結果：
　　 1一般資料
　　 99例自然流產(chǎn)患者年齡21～41歲,孕周6～16周,孕次1～9次,自然流產(chǎn)次數(shù)1～4。應用FISH技術將自然流產(chǎn)胚胎分為染色體數(shù)目異

13、常組(49例)和正常組(50例)。染色體數(shù)目異常組孕婦孕周(10.3±2.0)、年齡(30.04±4.9歲)、孕次(2.7±1.7)以及流產(chǎn)次數(shù)(1.44±0.6)與正常組孕婦孕周(10.24±2.5)、年齡(28.2±4.4歲)、孕次(2.1±1.2)以及流產(chǎn)次數(shù)(1.44±0.6)相比均無統(tǒng)計學差異(t=-0.101,P=0.92;Z=-1.881,P=0.06;Z=-1.852,P=0.06;Z=-0.226,P=0.82)。

14、r>　　 2自然流產(chǎn)胚胎絨毛組織中MAD2、BUB1 mRNA相對表達量
　　 異常組胚胎絨毛組織中MAD2 mRNA相對表達量為0.894±0.19,明顯高于正常組的0.79±0.21(t=-2.317,P=0.023);異常組胚胎絨毛組織中BUB1mRNA相對表達量(1.04±0.23)高于正常組(0.97±0.25),但差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.333,P=0.186)。
　　 3自然流產(chǎn)胚胎絨毛組織中MAD2

15、、BUB1蛋白相對表達量
　　 異常組胚胎絨毛組織中MAD2蛋白相對表達量為0.46±0.06,明顯高于正常組的0.42±0.08(t=-2.373,P=0.020);異常組胚胎絨毛組織中BUB1蛋白相對表達量(0.354±0.05)高于正常組(0.334±0.07),但差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.510,P=0.134)。
　　 結論：
　　 MAD2在胚胎染色體數(shù)目異常組中高表達,延長了SAC的有絲分裂阻滯持