1、目的：利用體外培養(yǎng)的人OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體系，通過(guò)不同的測(cè)定方法觀察三種細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β和LPS)對(duì)體外培養(yǎng)的人OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的蛋白聚糖的影響；并通過(guò)相同的實(shí)驗(yàn)體系初步了解PAR是否對(duì)人OA軟骨細(xì)胞的蛋白聚糖代謝具有保護(hù)作用。 方法：本研究分為三部分：①軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)和細(xì)胞活性的鑒定；②細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β及LPS對(duì)軟骨細(xì)胞蛋白聚糖代謝的調(diào)節(jié)作用；③PAR對(duì)TNF-α、IL-1β及LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)

2、胞蛋白聚糖代謝異常的保護(hù)作用。具體方法如下： 1.軟骨細(xì)胞取自人OA膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后的股骨髁。采用第一代體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，以細(xì)胞存活率大于95％為標(biāo)準(zhǔn)，選擇合適的細(xì)胞因子及PAR的作用濃度。 2.將軟骨細(xì)胞分為不同條件的培養(yǎng)組，分別為：對(duì)照組、PAR組、IL-1β組、TNF-α組、LPS組、PAR+IL-1β組、MR+TNF-α組及PAR+LPS組。 3.用二甲基亞甲蘭(1,9-dim

3、ethylmethy lerie blue，DMMB)分光光度法測(cè)定不同組軟骨細(xì)胞及培養(yǎng)液中的GAG含量，計(jì)算GAB釋放入培養(yǎng)液中的百分率。此為蛋白聚糖降解的標(biāo)記物，比較各組間的差別。 4.應(yīng)用抗蛋白聚糖單克隆抗體(Mab)-5D4及383，分別采用ELISA法及WesternBlotting法，檢測(cè)并比較不同條件培養(yǎng)液中的兩種蛋白聚糖代謝片段的含量。其中Mab-5D4可檢測(cè)蛋白聚糖核心蛋白的KS鏈，Mab-3B3可檢測(cè)蛋白聚糖

4、核心蛋白的CS鏈。 5.應(yīng)用半定量RT-PCR方法，測(cè)定不同條件培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中8種細(xì)胞成分的mRNA表達(dá)。8種細(xì)胞成分分別為：TNF-α、IL-1β、蛋白聚糖、ADAMTS-4、ADAMTS-5、TIMP-1、COX-lI及MAPK-1。 結(jié)果：1.在一定作用濃度的各種細(xì)胞因子及PAR作用下，除了LPS組的部分細(xì)胞形態(tài)略有梭形變外，其余各組細(xì)胞形態(tài)在光鏡下無(wú)明顯差別；各組細(xì)胞的存活率均大于95％。2.TNF-a、IL-

5、1β和LPS組軟骨細(xì)胞GAG釋放的百分率均明顯高于對(duì)照組，同時(shí)培養(yǎng)液中的5D4片段也明顯高于對(duì)照組；LPS組培養(yǎng)液中383片段明顯低于對(duì)照組，而TNF-a、IL-1β組培養(yǎng)液中的383片段與對(duì)照組比較無(wú)差別。3.TNF-α、IL-1β和LPS可不同程度地影響軟骨細(xì)胞內(nèi)不同細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)：①三種細(xì)胞因子均可上調(diào)軟骨細(xì)胞內(nèi)的ADAMTs-4、TNF-a、IL-1β及COX-II的mRNA表達(dá)；同時(shí)下調(diào)蛋白聚糖的mRNA表達(dá)。②TNF

6、-a和LPS可促進(jìn)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞內(nèi)ADAMTS-5及MAPK-1的mRNA表達(dá)；而IL-1β組此兩種細(xì)胞成分的mRNA表達(dá)與對(duì)照組無(wú)差別。③三種細(xì)胞因子對(duì)軟骨細(xì)胞的TIMP-1mRNA表達(dá)均無(wú)影響。4.PAR+IL-1β組、PAR+TNF-α及PAR+LPS組的軟骨細(xì)胞GAG的釋放率均低于其相應(yīng)的單獨(dú)細(xì)胞因子組。說(shuō)明PAR可分別抑制TNF-α、IL-1β及LPS所導(dǎo)致的體外培養(yǎng)的人OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞GAG的釋放。5.PAR+IL-1β組、

7、PAR+TNF-α及PAR+LPS組的培養(yǎng)液中5D4片段均低于其相應(yīng)的單獨(dú)細(xì)胞因子組，即PAR可抑制這三種細(xì)胞因子所導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞蛋白聚糖核心蛋白區(qū)硫酸角質(zhì)素鏈的降解。6.RT-PCR的結(jié)果顯示：①PAR可下調(diào)TNF-α、IL-1β及L2S所導(dǎo)致的體外培養(yǎng)的人OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)ADAMTS-5及TNF-α的mRNA過(guò)度表達(dá)；并同時(shí)上調(diào)蛋白聚糖mRNA表達(dá)。②PAR可下調(diào)IL-1β所致的ADAMTS-4的mRNA過(guò)度表達(dá)；③PAR可下調(diào)T

8、NF-α及IL-1β所致的IL-1β的mRNA過(guò)度表達(dá)；④PAR可下調(diào)TNF-α及LPS所致的COX-II及MAPK-1的mRNA過(guò)度表達(dá)。 結(jié)論：⑴在不改變細(xì)胞存活率的情況下，TNF-α、IL-1β及LPS可促進(jìn)體外培養(yǎng)的人OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞蛋白聚糖的降解，尤其是核心蛋白區(qū)硫酸角質(zhì)素鏈的降解.推斷三種細(xì)胞因子在OA的發(fā)病中起著一定的作用；而PAR可不同程度地減輕以上三種細(xì)胞因子所導(dǎo)致的蛋白聚糖降解。⑵TNF-α、IL-1βB和L