1、鮮切果蔬是鮮活農產品的一種新型果蔬加工產品，具有“新鮮、營養(yǎng)、方便、安全”的特點，消費者對鮮切果蔬的需求正持續(xù)快速增長，在人們日常生活中占據著重要的位置。果蔬在切分、加工過程中，造成人工機械傷害，使果蔬失去原有的保護組織，引發(fā)了呼吸速率加快、傷乙烯產生、酶促褐變加劇、產生次級代謝物等一系列生理生化反應。更重要的是切分后的產品組織營養(yǎng)物質外流，極易受食源性病原微生物侵染，而導致食源性疾病的爆發(fā)，危害消費者健康和生命安全。目前，常規(guī)食源性病

2、原微生物檢測方法存在操作步驟繁瑣、耗時長的缺點，檢測時間為5-7d，而鮮切果蔬貨架期和保質期只有3-5d。可見，常規(guī)的檢測方法無法滿足鮮切果蔬中食源性病原微生物的快速檢測和監(jiān)測。因此，開發(fā)鮮切果蔬食源性病原微生物高效、快速檢測技術和監(jiān)控技術是產業(yè)發(fā)展急需，具有重要的理論和現實意義。
　　本研究以鮮切果蔬為實驗材料，以主要引起食源性疾病的五種致病菌，即:單核增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157∶H7、鼠傷寒沙門氏菌和副溶

3、血性弧菌為目標菌。研發(fā)食源性病原微生物快速檢測技術和監(jiān)控技術，為鮮活農產品的加工、生產、物流過程的安全性提供技術支撐。取得主要研究結果如下:
　　1、揭示了食源性病原微生物在鮮切水果中的生長特性。本實驗以六種鮮切水果為研究對象，人工接種污染單核增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌等、大腸桿菌O157∶H7、鼠傷寒沙門氏菌，研究了食源性病原微生物在5℃、13℃和25℃下的生長狀況。結果表明，單核增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O1

4、57∶H7和鼠傷寒沙門氏菌都可在鮮切水果中顯著增長。溫度(13℃和25℃)越高生長較快，低溫(5℃)下不生長但處于存活狀態(tài)。金黃色葡萄球菌可以在鮮切菠蘿中生長，而其他目標菌在鮮切菠蘿中都不能生長。研究證明食源性病原微生物侵染于鮮切水果后，具有很強的生長與繁殖能力，具有引發(fā)食源性疾病的風險。溫度是影響食源性病原微生物生長的重要因素，也是保障鮮切果蔬安全的重要因素。
　　2、建立了鮮切果蔬食源性病原微生物多重PCR快速檢測技術。本研究

5、首先對四種目標菌的毒力基因進行設計及篩選特異性引物，經雙正交實驗優(yōu)化了多重PCR反應體系。結果表明，優(yōu)化的多重PCR反應體系對單核增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157∶H7、鼠傷寒沙門氏菌檢測的檢出限分別為3.5×106cfu/mL、2.4×105cfu/mL、4.8×105cfu/mL和1.6×105cfu/mL。在初始菌濃度為100、103、106cfu/mL時增菌培養(yǎng)9h后，檢出限可以達到100cfu/mL。該技術在人

6、工污染食源性病原微生物于鮮切萵苣、鮮切黃瓜、鮮切木瓜和鮮切哈密瓜等四種鮮切果蔬中的檢測研究中得到驗證，實現了對四種目標菌同時進行檢測。相較于傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法，檢測時間由5-7d縮短至9-12h。對于專業(yè)檢測機構或分析檢驗中心的批量樣品檢測具有實際意義。
　　3、建立了鮮切果蔬中食源性病原微生物多重熒光定量PCR快速檢測技術。針對以核酸檢測為基礎的分子生物學技術存在無法區(qū)分死菌和活菌的缺點，本研究將疊氮溴化丙錠與多重熒光定量PCR

7、技術相結合(PMA-MqPCR)，可通過修飾不完整細胞膜的死細胞中DNA，抑制細菌擴增，從而排除假陽性干擾。根據單核增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157∶H7、鼠傷寒沙門氏菌四種目標菌的靶基因設計特異性探針，選擇HEX、Cy5、FAM和ROX熒光基團修飾四條探針。經過正交實驗優(yōu)化后，建立了可檢測四種目標菌的多重熒光定量PCR快速檢測技術。檢出限分別為5.4×104cfu/mL、1.8×104cfu/mL、7.3×104cfu

8、/mL和4.2×104cfu/mL。同時，結合快速檢測技術研發(fā)，還研制了一種可以同時過濾果蔬殘渣并收集食源性病原微生物的雙層過濾裝置。該裝置由孔徑為15μm尼龍膜和0.22μm混合濾膜組成。將雙層過濾裝置與PMA-MqPCR技術相結合，可在不增菌的情況下，對鮮切果蔬中四種食源性病原微生物定量檢測，排除假陽性干擾，檢出限約為104cfu/g。檢測時間約為3-4h。
　　4、建立了食源性病原微生物原位合成基因芯片快速檢測技術。采用瓦片

9、式探針設計方式對單核增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157∶H7、鼠傷寒沙門氏菌和副溶血性弧菌五種目標菌靶基因進行探針設計與篩選，比對NCBI數據庫中五種目標菌的特異性序列，獲取靶基因，優(yōu)化雜交體系。結果表明，對3227條雜交探針進行篩選，最終篩選得到141條特異性探針，即:單核增生性李斯特菌探針數為26條，金黃色葡萄球菌探針數24條，大腸桿菌O157∶H7探針數為25條，鼠傷寒沙門氏菌探針數為20條，副溶血性弧菌探針數為46

10、條。將建立的原位合成基因芯片快速檢測技術應用于鮮切果蔬食源性病原微生物檢測，獲得了擴增信號強、準確性高。在未富集培養(yǎng)的情況下，檢出限約為103cfu/g，檢測時間約為24h。篩選獲得的引物和探針具有廣譜性和獨創(chuàng)性，為DNA微列陣芯片、可視化芯片快速檢測技術的研發(fā)奠定基礎。
　　本研究建立的食源性病原微生物檢測技術可在鮮切果蔬原料處理、清洗、鮮切加工、包裝、貯藏、物流、銷售等全鏈條中有效對食源性病原微生物檢測、監(jiān)測，并實施防控，提高