1、目的:
　　 瘧疾是由瘧原蟲引起的嚴重危害人類健康的重要傳染性疾病之一。而作為瘧疾的重要并發(fā)癥，腦型瘧疾（腦瘧）是引起瘧疾感染患者死亡的主要原因。目前仍然沒有有效的措施可以控制腦型瘧疾的發(fā)生與進展。當前學者們普遍認為機體過度的炎性反應與腦瘧的發(fā)生密切相關。因此通過調控瘧疾患者機體的炎性應答來防控腦瘧一直是重要的研究方向。近年來眾多的研究發(fā)現一些造血細胞生成因子除了具有促進血細胞生成的作用之外，還具有其他的非造血功能。如促紅細胞生

2、成素(EPO)可促進紅細胞生成，還具有抗炎性反應等多種功能，并被證實能夠抑制實驗性腦型瘧疾的發(fā)生。而作為最主要的促血小板生成因子，促血小板生成素(TPO)在分子結構上與EPO具有一定的同源性(23％)，且其受體c-Mpl也表達于某些免疫細胞，并可在一定程度上影響免疫細胞的功能。腦瘧的發(fā)病機制及臨床表現與腦栓塞具有一定共性，而近期有研究證實在大鼠的實驗性缺血性腦栓塞模型中，重組人促血小板生成素(rhTPO)能通過降低MMP-9水平阻斷抑制

3、血腦屏障的破壞。由于炎性反應能夠誘導MMP-9的產生，有理由推測TPO可能是通過降低炎性反應抑制血腦屏障的破壞。而rhTPO可能因此能夠在腦瘧中的發(fā)揮保護性作用。為此，本研究擬利用rhTPO處理感染后的小鼠腦瘧模型，探討rhTPO對小鼠實驗性腦瘧發(fā)生的影響及其免疫相關機制。
　　 材料與方法:
　　 1.實驗動物模型構建與分組
　　 6-8周齡，雌性C57BL/6小鼠（購買于北京動物研究所）隨機分為3組，正常對照

4、組（不予任何處理與干預），感染對照組，rhTPO處理感染組。感染對照組與rhTPO處理感染組小鼠經腹腔感染1×106 P.bANKA(PbA)寄生的紅細胞(pRBC)，構建腦瘧模型。rhTPO處理感染組于感染后第一天經尾靜脈注射一次rhTPO(4μg/kg)。實驗期間動態(tài)觀察生存率，制備薄血涂片，Giemsa染色，鏡檢計數紅細胞感染率。
　　 2.血腦屏障(BBB)通透性檢測
　　 感染后第5-12天，小鼠出現腦瘧癥狀，

5、通過尾靜脈注射伊文思藍(Evans blue)檢測血腦屏障通透性變化。
　　 3.腦組織病理及免疫組化
　　 感染后第5天，獲取各組小鼠全腦，制備石蠟切片，HE染色觀察腦組織病理變化，免疫組化染色觀察統(tǒng)計表達VCAM-1與ICAM-1的大腦皮質微血管數量。
　　 4.腦組織mRNA檢測樣本的留存
　　 感染后第5天，獲取小鼠全腦，置于RNAlater中，-20℃保存，待實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-

6、Time PCR)檢測細胞因子的mRNA水平。
　　 5.腦組織單個核細胞分離
　　 感染后第5天，用Percoll分離全腦單個核細胞，流式細胞術檢測CD4+T與CD8+T細胞水平。
　　 6.血液學分析
　　 感染前（第0天）及感染后第3、5、8天，經眼球取血，獲得EDTA抗凝血，自動血細胞分析儀檢測紅細胞與血小板數量。
　　 7.獲取血清
　　 感染前（第0天）及感染后第3、5天，經眼

7、球取血，分離血清，-20℃凍存，待細胞因子檢測。
　　 8.制備脾臟單個核細胞懸液
　　 感染前（第0天）及感染后第3、5天，無菌制備脾臟單個核細胞懸液，其中部分細胞經48小時培養(yǎng)后，收集上清，-20℃凍存，待細胞因子檢測;部分細胞溶解于Trizol中，-70℃凍存，待Real-Time PCR檢測細胞因子的mRNA水平;部分細胞用于流式細胞術檢測不同免疫細胞亞群的水平。
　　 9.流式細胞術
　　 流式

8、細胞術檢測感染后第5天腦組織單個核細胞中CD4+T與CD8+T細胞的水平，感染前（第0天）及感染后第3、5天脾臟中Th1細胞、調節(jié)性T細胞（Tregs）水平、不同樹突狀細胞(DCs)亞群及其功能相關分子的水平，外周血活化血小板的水平。
　　 10.Real-Time PCR
　　 Real-Time PCR檢測感染后第5天腦組織及第3、5天脾細胞腦瘧相關細胞因子的mRNA水平。
　　 11.酶聯(lián)免疫吸附測定(EL

9、ISA)
　　 ELISA檢測感染前（第0天）及感染后第3、5天脾細胞培養(yǎng)上清與血清中細胞因子水平。
　　 12.Griess法
　　 Griess法檢測感染前（第0天）及感染后第3、5天脾細胞培養(yǎng)上清中NO2-濃度。
　　 13.統(tǒng)計學分析
　　 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數據進行處理，標本采用獨立樣本t檢驗比較分析組內和組間均值差異，采用Kaplan-Meyer方法進行生存期分析。P＜0.

10、05為顯著差異。
　　 實驗結果:
　　 rhTPO可以顯著抑制感染PbA的C57BL/6小鼠的實驗性腦瘧的發(fā)生，但不改變原蟲血癥。rhTPO明顯抑制感染小鼠血腦屏障對伊文思藍的通透性。rhTPO抑制感染小鼠腦部炎性反應的升高。腦組織切片的HE染色結果顯示，rhTPO處理感染組的腦皮質血管炎性細胞聚集與粘附現象明顯少于感染對照組。腦部單個核細胞中CD4+T與CD8+T細胞水平，在rhTPO處理組明顯低于感染對照組。與感染

11、對照組相比，在rhTPO處理組，腦部與腦瘧發(fā)生密切相關的炎性細胞因子(IFN-γ、TNF-α)和趨化因子(CXCL9與CXCL10)的mRNA水平明顯下調，MMP-9的mRNA水平降低，而TGF-β1的mRNA水平顯著升高。腦組織免疫組化結果顯示，在rhTPO處理組，表達粘附分子VCAM-1與ICAM-1的大腦皮質微血管數量顯著低于感染對照組，與此相一致的是，腦部VCAM-1與ICAM-1的mRNA水平，在rhTPO處理組明顯低于感染對

12、照組。血清細胞因子的ELISA檢測結果顯示感染后第5天，rhTPO處理組的IFN-γ、TNF-α水平顯著低于感染對照組。脾臟的相關指標檢測表明rhTPO能夠顯著影響機體的免疫應答。與感染對照組相比，rhTPO處理感染組的Th1免疫應答顯著降低，表現為感染后第3、5天Th1細胞水平下降，脾細胞產生的NO減少，感染后第5天的IFN-γ與TNF-α蛋白及mRNA水平明顯下調，而Tregs水平顯著升高。感染后第3天，rhTPO處理感染組的髓樣樹

13、突狀細胞(mDCs)及DCs功能相關分子(MHCII、CD86、TLR4、TLR9)水平明顯低于感染對照組。rhTPO介導保護作用的同時，不影響外周血紅細胞與血小板數量，但降低感染后第3天的活化血小板水平。
　　 結論:
　　 1.rhTPO能夠顯著抑制感染PbA的C57BL/6小鼠實驗性腦瘧的發(fā)生;
　　 2.rhTPO可明顯抑制實驗性腦瘧模型小鼠血腦屏障通透性的增加;
　　 3.rhTPO能夠明顯降低