1、雞球蟲(chóng)病是由艾美耳屬球蟲(chóng)寄生于雞腸上皮細(xì)胞內(nèi)所引起的一種原蟲(chóng)病，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。臨床上雞球蟲(chóng)病一般由兩種或兩種以上的球蟲(chóng)混合感染所致。本試驗(yàn)采用玻璃紙單卵囊分離法成功分離到一株球蟲(chóng)，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，最終確定為巨型艾美耳球蟲(chóng)合肥(HF)株；用所獲球蟲(chóng)感染雛雞，對(duì)其感染后不同階段雛雞生理生化指標(biāo)的變化進(jìn)行研究。
　　 首先，采集合肥市肥西縣某雞場(chǎng)具有球蟲(chóng)病典型癥狀的雞糞樣，用飽和鹽水漂浮法分離艾美耳球

2、蟲(chóng)混合毒株，顯微鏡檢查有無(wú)巨型艾美耳球蟲(chóng)卵囊。對(duì)含有巨型艾美耳球蟲(chóng)的卵囊液，加入20倍體積的2.5％重鉻酸鉀溶液，置于28℃恒溫培養(yǎng)，待完全孢子化后，準(zhǔn)備進(jìn)行巨型艾美耳球蟲(chóng)的單卵囊分離。以玻璃紙作為載體分離單卵囊：首先將卵囊液稀釋?zhuān)慈∫坏沃?.5cm×0.5cm玻璃紙上，根據(jù)卵囊的形態(tài)學(xué)特征，初步選擇僅有1個(gè)卵囊的玻璃紙作為備用，然后用空殼膠囊進(jìn)行包裹，將其經(jīng)口接種至20只5日齡的雛雞。接種后第5天開(kāi)始收集糞樣，并對(duì)其感染情況進(jìn)行檢查

3、。
　　 其次，對(duì)單卵囊接種獲得的球蟲(chóng)進(jìn)行增殖，即將上述單卵囊后代接種至12日齡的雛雞，自接種120h后，每小時(shí)做一次球蟲(chóng)糞便學(xué)檢查，并記錄第一次出現(xiàn)球蟲(chóng)的時(shí)間，用沉浮法收集球蟲(chóng)卵囊，測(cè)定最短孢子化時(shí)間。
　　 再次，對(duì)卵囊液進(jìn)行濃縮，按照常規(guī)DNA抽提法進(jìn)行球蟲(chóng)DNA的抽提。根據(jù)Yao-ChiSu等設(shè)計(jì)的巨型艾美耳球蟲(chóng)特異性引物：E.M1:5′-TTGTGGGGCATATTGTTGTG-3′；E.M2:5′-CAATG

4、AGGCACCACATGTCT-3′進(jìn)行PCR反應(yīng)。對(duì)所擴(kuò)增的基因進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行比對(duì)分析。
　　 最后，將巨型艾美耳球蟲(chóng)(HF)株按照5×104個(gè)/只的劑量感染80只21日齡雛雞，選擇感染后0d，7d，11d，15d心臟采血，測(cè)定平均體重和免疫器官指數(shù)、血液成分以及免疫等指標(biāo)。
　　 結(jié)果表明：(1)采用單卵囊技術(shù)分離艾美耳球蟲(chóng)并對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物感染，在20只雞中有6只感染成功，其感染率達(dá)30％；(2)對(duì)單卵囊所分離的艾美耳

5、球蟲(chóng)進(jìn)行增殖，其第二代卵囊(按50個(gè)計(jì)算)大小為27.51～36.68μm×20.96～31.44μm，平均為32.18μm×25.84μm，卵形指數(shù)為1.25，潛隱期為130h，最短孢子化時(shí)間為35h。將單卵囊后代(第一代)與增值后(第二代)的球蟲(chóng)卵囊大小進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(F檢驗(yàn))，結(jié)果顯示差異不顯著(P>0.05)，表明第二代球蟲(chóng)與第一代卵囊大小相同，且球蟲(chóng)卵囊大小、潛隱期和最短孢子化時(shí)間均符合巨型艾美耳球蟲(chóng)的特征。因此，初步鑒定

6、本試驗(yàn)分離的蟲(chóng)株為巨型艾美耳球蟲(chóng)，暫命名為巨型艾美耳球蟲(chóng)合肥(HF)株；(3)采用分子生物學(xué)方法進(jìn)一步對(duì)所增殖卵囊進(jìn)行鑒定時(shí)，成功擴(kuò)增出151bp的特異性片段。序列分析顯示，所擴(kuò)增的基因與已報(bào)道的巨型艾美耳球蟲(chóng)同一基因有高度的同源性；(4)動(dòng)物試驗(yàn)顯示：攻蟲(chóng)后7d，法氏囊指數(shù)顯著下降(P<0.05)，總蛋白、白蛋白極顯著下降(P<0.01)，血清Mg、IgA、IFN-γ顯著升高(P<0.05)，單核細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、過(guò)氧化氫酶(C

7、AT)和NO均極顯著升高(P<0.01)；感染11d，平均體重、法氏囊指數(shù)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和堿性磷酸酶(ALP)均極顯著下降(P<0.01)，脾臟指數(shù)顯著下降(P<0.05)，單核細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和IgG極顯著升高(P<0.01)，過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)顯著升高(P<0.05)；感染15d，平均體重，脾臟指數(shù)表現(xiàn)極顯著下降(P<0.01)，過(guò)氧化氫酶(CAT)，超氧化物

8、歧化酶(SOD)顯著升高(P<0.05)，單核細(xì)胞、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均極顯著升高(P<0.01)；整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，血清Na、K、P、紅細(xì)胞、血紅蛋白、血糖、IgM、IL-2、乳酸脫氫酶(LDH)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)與對(duì)照組相比均未表現(xiàn)明顯變化(P>0.05)。
　　 綜上所述，本研究成功地優(yōu)化了一種球蟲(chóng)單卵囊分離技術(shù)，應(yīng)用此技術(shù)分離到一株艾美耳球蟲(chóng)，對(duì)該株球蟲(chóng)進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定為巨型艾美耳球蟲(chóng)(HF)株；用該株