1、雞球蟲病是由艾美耳屬球蟲寄生于雞腸上皮細胞內所引起的一種原蟲病，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經濟損失。臨床上雞球蟲病一般由兩種或兩種以上的球蟲混合感染所致。本試驗采用玻璃紙單卵囊分離法成功分離到一株球蟲，并對其進行形態(tài)學和分子生物學鑒定，最終確定為巨型艾美耳球蟲合肥(HF)株；用所獲球蟲感染雛雞，對其感染后不同階段雛雞生理生化指標的變化進行研究。
　　 首先，采集合肥市肥西縣某雞場具有球蟲病典型癥狀的雞糞樣，用飽和鹽水漂浮法分離艾美耳球

2、蟲混合毒株，顯微鏡檢查有無巨型艾美耳球蟲卵囊。對含有巨型艾美耳球蟲的卵囊液，加入20倍體積的2.5％重鉻酸鉀溶液，置于28℃恒溫培養(yǎng)，待完全孢子化后，準備進行巨型艾美耳球蟲的單卵囊分離。以玻璃紙作為載體分離單卵囊：首先將卵囊液稀釋，沾取一滴至0.5cm×0.5cm玻璃紙上，根據(jù)卵囊的形態(tài)學特征，初步選擇僅有1個卵囊的玻璃紙作為備用，然后用空殼膠囊進行包裹，將其經口接種至20只5日齡的雛雞。接種后第5天開始收集糞樣，并對其感染情況進行檢查

3、。
　　 其次，對單卵囊接種獲得的球蟲進行增殖，即將上述單卵囊后代接種至12日齡的雛雞，自接種120h后，每小時做一次球蟲糞便學檢查，并記錄第一次出現(xiàn)球蟲的時間，用沉浮法收集球蟲卵囊，測定最短孢子化時間。
　　 再次，對卵囊液進行濃縮，按照常規(guī)DNA抽提法進行球蟲DNA的抽提。根據(jù)Yao-ChiSu等設計的巨型艾美耳球蟲特異性引物：E.M1:5′-TTGTGGGGCATATTGTTGTG-3′；E.M2:5′-CAATG

4、AGGCACCACATGTCT-3′進行PCR反應。對所擴增的基因進行測序，并進行比對分析。
　　 最后，將巨型艾美耳球蟲(HF)株按照5×104個/只的劑量感染80只21日齡雛雞，選擇感染后0d，7d，11d，15d心臟采血，測定平均體重和免疫器官指數(shù)、血液成分以及免疫等指標。
　　 結果表明：(1)采用單卵囊技術分離艾美耳球蟲并對試驗動物感染，在20只雞中有6只感染成功，其感染率達30％；(2)對單卵囊所分離的艾美耳

5、球蟲進行增殖，其第二代卵囊(按50個計算)大小為27.51～36.68μm×20.96～31.44μm，平均為32.18μm×25.84μm，卵形指數(shù)為1.25，潛隱期為130h，最短孢子化時間為35h。將單卵囊后代(第一代)與增值后(第二代)的球蟲卵囊大小進行差異顯著性檢驗(F檢驗)，結果顯示差異不顯著(P>0.05)，表明第二代球蟲與第一代卵囊大小相同，且球蟲卵囊大小、潛隱期和最短孢子化時間均符合巨型艾美耳球蟲的特征。因此，初步鑒定

6、本試驗分離的蟲株為巨型艾美耳球蟲，暫命名為巨型艾美耳球蟲合肥(HF)株；(3)采用分子生物學方法進一步對所增殖卵囊進行鑒定時，成功擴增出151bp的特異性片段。序列分析顯示，所擴增的基因與已報道的巨型艾美耳球蟲同一基因有高度的同源性；(4)動物試驗顯示：攻蟲后7d，法氏囊指數(shù)顯著下降(P<0.05)，總蛋白、白蛋白極顯著下降(P<0.01)，血清Mg、IgA、IFN-γ顯著升高(P<0.05)，單核細胞、白細胞、淋巴細胞、過氧化氫酶(C

7、AT)和NO均極顯著升高(P<0.01)；感染11d，平均體重、法氏囊指數(shù)、谷丙轉氨酶(ALT)和堿性磷酸酶(ALP)均極顯著下降(P<0.01)，脾臟指數(shù)顯著下降(P<0.05)，單核細胞、白細胞、淋巴細胞和IgG極顯著升高(P<0.01)，過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GSH-PX)和超氧化物歧化酶(SOD)顯著升高(P<0.05)；感染15d，平均體重，脾臟指數(shù)表現(xiàn)極顯著下降(P<0.01)，過氧化氫酶(CAT)，超氧化物

8、歧化酶(SOD)顯著升高(P<0.05)，單核細胞、白細胞和淋巴細胞均極顯著升高(P<0.01)；整個試驗過程中，血清Na、K、P、紅細胞、血紅蛋白、血糖、IgM、IL-2、乳酸脫氫酶(LDH)和谷草轉氨酶(AST)與對照組相比均未表現(xiàn)明顯變化(P>0.05)。
　　 綜上所述，本研究成功地優(yōu)化了一種球蟲單卵囊分離技術，應用此技術分離到一株艾美耳球蟲，對該株球蟲進行了形態(tài)學和分子生物學鑒定，確定為巨型艾美耳球蟲(HF)株；用該株