1、殼聚糖是甲殼素脫乙?；漠a物,由2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖聚合構成,生物學功能豐富,已有研究表明殼聚糖及其降解產物殼寡糖可以有效地抑制大腸桿菌的生長,且具有無毒、易降解、生物相容性等優(yōu)點,應用前景廣闊。目前,關于殼聚糖及殼寡糖對微生物的抑制規(guī)律已有大量的研究報道,其中包括殼聚糖會破壞微生物的細胞膜的滲透性,會引起微生物胞內活性氧的含量增加等,但關于其抑菌機理方面的認識不足。本論文采用生物化學分析和蛋白質組學的方法,開展了殼寡糖在

2、抑制大腸桿菌生長過程中引起的生物分子動態(tài)變化的研究,結果如下。
　　利用平板計數(shù)法測定殼寡糖處理對大腸桿菌生長的抑制效果,結果表明在0.5％殼寡糖的作用下,活菌數(shù)表現(xiàn)為先減少后增多,而1%殼寡糖的處理使活菌數(shù)逐漸減少,抑菌效果明顯。通過檢測胞內堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶和β-半乳糖苷酶的外泄情況得出在0.5%和1%殼寡糖的作用下,大腸桿菌的菌體完整性遭到了一定程度的破壞。應用流式細胞術檢測了大腸桿菌的凋亡情況:大腸桿菌在培養(yǎng)2h、4h

3、和6h的情況下,細胞凋亡程度逐漸增強,而壞死程度基本穩(wěn)定。綜合分析大腸桿菌凋亡實驗結果、活菌數(shù)結果及菌體完整性的實驗結果,表明大腸桿菌的生長在受到殼寡糖影響時表現(xiàn)為壞死程度相對穩(wěn)定而凋亡程度不斷增加,說明殼寡糖可能主要是通過誘導大腸桿菌發(fā)生凋亡來發(fā)揮抑菌作用的。
　　大腸桿菌在0.5%和1%殼寡糖的處理下,胞內活性氧濃度快速升高,隨后逐漸降低,1%殼寡糖處理組變化趨勢較0.5%殼寡糖處理組明顯,而且在相同的時間下1%殼寡糖處理組活

4、性氧的相對含量高于0.5%殼寡糖處理組。在氧化性損傷的測定中,在0.5%和1%殼寡糖的處理下,膜質的氧化損傷,蛋白質的氧化損傷嚴重,丙二醛含量、蛋白質羰基化和硝基化含量明顯高于對照組,0.5%殼寡糖處理的大腸桿菌在0-4 h內丙二醛含量、蛋白質羰基化和硝基化含量逐漸增加,而在4-16 h其含量逐漸減少。1%殼寡糖處理的大腸桿菌隨著時間的延長膜質和蛋白質氧化損傷逐漸增強。而DNA氧化損傷,在0.5%和1%殼寡糖的處理下,8-羥基脫氧鳥苷的

5、含量在2h和4h與對照組有明顯差異外,在其他時間內DNA氧化損傷作用不明顯。上述結果表明殼寡糖處理可能通過誘導胞內活性氧濃度增加和積累進而導致生物分子的氧化損傷,影響大腸桿菌的生長。
　　利用蛋白質組學技術檢測了殼寡糖處理后大腸桿菌胞內蛋白質表達的差異情況。大腸桿菌在0.5%和1%殼寡糖處理下培養(yǎng)4 h,提取的大腸桿菌總蛋白經雙向電泳分離,綜合處理組與對照組蛋白點的差異與不同,共分離得到1150個蛋白點,對蛋白質的2-D電泳圖譜進

6、行比對分析,選擇2倍差異變化的蛋白點作為分析對象,結合膠上蛋白點的實際情況對其中的42個蛋白點進行質譜分析鑒定,成功鑒定出40個蛋白點,這些蛋白點屬于35種蛋白質,殼寡糖處理組與對照組相比有28個蛋白點表達量上調,有10個蛋白點表達量下調,有2個特殊點在0.5%殼寡糖處理組與1%殼寡糖處理組和對照組之間呈現(xiàn)不同。為了進一步了解差異表達蛋白的功能,鑒定得到的蛋白質進行功能聚類分析,結果表明上述蛋白主要參與物質代謝、蛋白質合成和氧化還原等。