1、目的：觀察四種骨質(zhì)疏松治療藥物(維生素K2、甲狀旁腺激素、活性維生素D3、阿倫膦酸鈉)對(duì)體外培養(yǎng)SD大鼠成骨細(xì)胞基質(zhì)gla蛋白(MGP)mRNA表達(dá)的影響，探討MGP在骨質(zhì)疏松發(fā)病中的可能作用。
　　 方法：1.采用胰酶-膠原酶序貫消化法獲得新生1-3天內(nèi)SD大鼠顱蓋骨成骨細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)。2.取第二代細(xì)胞經(jīng)Ⅰ型膠原、ALP、礦化結(jié)節(jié)染色進(jìn)行成骨細(xì)胞表型鑒定。3.取第四代成骨細(xì)胞，分別給予不同濃度的維生素K2、甲狀旁腺激素(P

2、TH)、活性維生素D3、阿倫膦酸鈉干預(yù)培養(yǎng)24h：維生素K2(10-7、10-6、10-5mol/L)，PTH(1-34)(10-9、10-8、10-7mol/L)，活性維生素D3(10-10、10-9、10-8mol/L)，阿倫膦酸鈉(10-6、10-5、10-4mol/L)，每種藥物均設(shè)立空白對(duì)照。4.培養(yǎng)24h后抽提成骨細(xì)胞總RNA，采用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞MGP mRNA表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果：1.原代

3、成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：經(jīng)胰酶-膠原酶序貫消化法獲得的顱骨骨片貼壁后7-10天細(xì)胞從骨片爬出，5-6天后許多組織塊爬出的細(xì)胞已匯合成單層甚至呈重疊生長(zhǎng)，7-8天后細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到高峰。2.成骨細(xì)胞的表型鑒定：①Ⅰ型膠原染色：Van Gieson苦味酸酸性復(fù)紅染色呈棕紅色，說(shuō)明細(xì)胞有合成基質(zhì)蛋白的功能。②ALP染色：用改良的鈣鈷法(Gomori法)染色顯示細(xì)胞內(nèi)棕黑細(xì)微顆粒，說(shuō)明細(xì)胞ALP活性增高，細(xì)胞骨基質(zhì)的成熟。③礦化結(jié)節(jié)染色：原代SD大鼠成

4、骨細(xì)胞在β-甘油磷酸鈉存在的情況下培養(yǎng)1月，可形成礦化結(jié)節(jié)。3.維生素K2、PTH(1-34)、活性維生素D3、阿倫膦酸鈉對(duì)成骨細(xì)胞MGP mRNA表達(dá)的影響：①維生素K2上調(diào)成骨細(xì)胞MGP mRNA的表達(dá)，濃度為10-5mol/L時(shí)成骨細(xì)胞MGP mRNA的表達(dá)量是空白對(duì)照組的2.56倍，濃度為10-7mol/L和10-6mol/L時(shí)成骨細(xì)胞MGP mRNA的表達(dá)量分別是對(duì)照組的1.57倍和2.12倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05

5、)。②PTH(1-34)上調(diào)成骨細(xì)胞MGP mRNA的表達(dá)，濃度為10-7mol/L時(shí)成骨細(xì)胞MGP mRNA的表達(dá)量是空白對(duì)照組的6.78倍，濃度為10-9mol/L和10-8mol/L時(shí)成骨細(xì)胞MGP mRNA的表達(dá)量分別是對(duì)照組的2.23倍和5.31倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。③活性維生素D3上調(diào)成骨細(xì)胞MGPmRNA的表達(dá)，濃度為10-8mol/L時(shí)成骨細(xì)胞MGP mRNA的表達(dá)量是空白對(duì)照組的8.93倍，濃度為10

6、-10mol/L和10-9mol/L肘成骨細(xì)胞MGP mRNA的表達(dá)量分別是對(duì)照組的3.47倍和6.95倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。④阿倫膦酸鈉上調(diào)成骨細(xì)胞MGP mRNA的表達(dá)，濃度為10-4mol/L時(shí)成骨細(xì)胞MGP mRNA的表達(dá)量是空白對(duì)照組的3.47倍，濃度為10-6mol/L和10-5mol/L時(shí)成骨細(xì)胞MGP mRNA的表達(dá)量分別是對(duì)照組的1.98倍和2.49倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。