1、由真菌病原菌引起的果實采后病害對人們造成了嚴重的經(jīng)濟損失。用拮抗酵母取代化學殺菌劑，或降低化學殺菌劑的使用量(即生物防治BCPD)，具有良好的應用前景，但是普通拮抗菌很難達到化學殺菌劑的殺菌效果，因而篩選新型拮抗菌或提高原有拮抗菌拮抗效力成為了該領域的研究熱點。通過基因工程技術改造拮抗酵母從而提高其生防效果是果蔬采后病害生物防治的新方法。本文探討了將抗菌肽基因轉移到酵母中表達以提高其生防效果的方法，成功的將外源抗菌肽基因Cecropin

2、A和PsdI在畢赤酵母中進行表達并對重組酵母GS115/CEC、GS115/PSD的安全性及對果蔬采后的主要致病菌和果蔬真菌病原菌引起的腐爛的抑制效果進行了研究：探討了該酵母與外源物質結合使用對果蔬采后病害抑制效果的影響；初步研究了該酵母對果蔬致病菌的抑制機理及對果蔬貯藏后品質的影響，其主要研究結果如下：
　　 (1)根據(jù)已報道基因序列合成抗菌肽Cecropin A和PsdI基因片段，并將其連接到PGEM-T載體上。在此基礎上將

3、目的基因插入酵母表達載體pPIC9K，構建畢赤酵母表達載體。將其線性化后，用電轉化法導入Pichia Pastoris GS115中。采用G418進行梯度篩選高抗性轉化子。以甲醇作為誘導物，取發(fā)酵培養(yǎng)3d后的發(fā)酵上清液，進行Tricine-SDS-PAGE驗證了基因表達的正確性。并且經(jīng)接種培養(yǎng)、誘導發(fā)酵及PCR鑒定等驗證了重組酵母具有良好的穩(wěn)定性。
　　 (2)通過對重組畢赤酵母GS115/CEC、GS115/PSD發(fā)酵過程的兩

4、個階段發(fā)酵條件的優(yōu)化實驗，得出生長階段優(yōu)化后的發(fā)酵工藝為：甘油2％，硫酸銨2％，pH=6.5-7.5，30℃條件下培養(yǎng)72h。外源基因誘導表達階段優(yōu)化后的發(fā)酵工藝為：甲醇1％，硫酸銨2％，pH=7.0，30℃條件下培養(yǎng)72h。采用正交實驗來優(yōu)化畢赤酵母的發(fā)酵條件，其影響發(fā)酵的主要因素及影響的大小依次為：溫度>甲醇濃度>發(fā)酵天數(shù)>溶液pH值。最終得到重組畢赤酵母發(fā)酵過程中各項影響因素的優(yōu)化值，即pH5.5，甲醇濃度為1％，溫度為30℃，時

5、間為4d，在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下，重組酵母GS115/CEC、GS115/PSD表達的外源蛋白含量平均可達15.1及11.3 mg/L。
　　 (3)利用重組酵母對4種果實的4種主要采后致病菌進行了體外及體內生防實驗：平板抑菌實驗及液體抑菌實驗均表明重組酵母在體外對病原菌有廣譜抑菌活性；實驗表明該重組酵母可顯著抑制鏈格孢、灰葡萄孢在番茄果實上的侵染；抑制擴展青霉引起的蘋果及梨的腐爛；抑制灰葡萄孢引起的梨和蘋果腐爛。同時實驗表明，重

6、組酵母對病原真菌的抑制效力與其細胞懸浮液的濃度有關，濃度越高，對致病菌的抑制作用也越強。
　　 (4)對重組酵母抑菌機理的研究結果表明，抑菌機制除體現(xiàn)了傳統(tǒng)的營養(yǎng)與空間的競爭外，采用掃描電鏡、透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)表達抗菌肽基因的重組酵母處理的真菌外部形態(tài)和內部結構都發(fā)生了很大的變化，出現(xiàn)了畸形，破裂，斷殘等現(xiàn)象。證實了其對真菌的膜結構及細胞內部結構的損壞作用。
　　 (5)在以上工作的基礎上，進一步從分子水平研究了表達抗菌肽

7、基因的重組酵母對真菌的作用機制。凝膠阻滯實驗證明，抗菌肽能與真菌的RNA結合，影響了它們在電泳中的遷移率，同時還能使真菌的DNA及RNA降解，因而真菌細胞的代謝過程受到破壞，最終導致了真菌的死亡。此外，重組酵母能誘導與果實抗性相關的PR蛋白過量表達，因此誘導果實的自身抗性可能也是抑菌機制的一部分。
　　 (6)重組酵母能和外源物質相結合，顯著增強對果實采后病害的防治效果：重組酵母和適當濃度金屬鹽類(氯化鈣)、碳酸鹽及乙醇結合使用